Пробиотический консорциум на основе Lactobacillus fermentum BV-4 и Lactobacillus salivarius BV-1

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/225 (2006.01) 61 35/74 (2006.01) 61 15/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ профилактическим и лечебным действием при дисбактериозах влагалища женщин. Созданный на основе биологически активных штаммов лактобацилл, консорциум обладает пробиотическими свойствами,которые конкурируют с целым рядом лекарственных средств антибактериальной направленности. Консорциум обладает высокой антагонистической активностью в отношении условнопатогенной и патогенной микрофлоры Е...,. а, адгезивной активностью,устойчив к ряду антибиотиков. Зоны угнетения роста тест- штаммов, мм Е.21,0 .15,0 .26,0 .20,0 .17,025,0. Консорциум рекомендуется использовать в качестве основы бактериального препарата для профилактики и лечения дисбактериозов влагалища женщин.(72) Наызбекызы Эльвира Садуахасова Сауле Абдуахаповна Абитаева Гуляим Каиркеновна Шахабаева Гульнара Сакеновна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ПРОБИОТИЧЕСКИЙ КОНСОРЦИУМ НА ОСНОВЕ 4 И-1(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности, к способу получения пробиотического консорциума,обладающего Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности, к способу получения пробиотического консорциума,обладающего профилактическим и лечебным действием при бактериальном вагинозе. Изобретение представляет способ получения молочнокислых бактерий для создания пробиотического консорциума с целью профилактики и лечения бактериального вагиноза. Аналог изобретения. Из известных способов наиболее близким к заявленному является способ получения пробиотиков в капсулах Вагилакт на основе пробиотического консорциума, состоящий из суспензии клеток-1 и-1. Потенциальная эффективность перорального приема лактобацилл в качестве нехимиотерапевтического средства для восстановления и сохранения нормальной урогенитальной флоры показывает, что требуемая доза составляет свыше 108 жизнеспособных организмов в день. Повторный прием пробиотиков может иметь значение не только для женщин,склонных к урогенитальным инфекциям, но также для здоровых женщин, поскольку часто их вагинальная флора испытывает недостаток лактобацилл, что повышает риск возникновения инфекций,С, -..,,). Появились доказательства, что определенные штаммы могут действовать эффективно при прямом введении во влагалище или когда они восходят из прямой кишки после перорального приема.,,С.,.,В Два штамма-1 и,.,.,., Задача изобретения - получить пробиотический консорциум для лечения и профилактики бактериального вагиноза. Технический результат, может быть, достигнут при совместном культивировании молочнокислых бактерий-4,-1, выделенных из влагалищного отделяемого женщин репродуктивного возраста. Пробиотический консорциум обладает антагонистической активностью к ряду условнопатогенных и патогенных микроорганизмов,,, ,,, адгезивной активностью, устойчивостью к антибиотикам. Достижения технического результата позволяет получить пробиотический консорциум, состоящий из-4 и-1. Бактериальный вагиноз (БВ) - это состояние, при котором воспаляется слизистая влагалища,грамотрицательные бактерии образуют колонии во влагалище за счет вымещения лактобактерий,увеличивается 4,5, в некоторых случаях это сопровождается запахом и выделениями. БВ значительно повышает риск заражения инфекциями,2 передаваемыми половым путем, включая ВИЧ Кингслей Анукам, Эммануэль Осацува, Иджеома Ахонкхай, Михаель Нгву, Гибсон Осемене, Андрей В. Брюс и Грегор Рейд. За последнее десятилетие интерес и внимание специалистов к вопросам адекватного и эффективного лечения заболеваний бактериального вагиноза значительно возрос. Многочисленными исследованиями подтверждена важная роль микробного фактора в этиологии бактериального вагиноза. В исследованиях, проведенных в последнее время,подчеркивалось значение здоровой флоры с преобладанием лактобацилл не только в предотвращении сексуально-трансмиссивных заболеваний, , , ., но и преждевременных родов.,М., и поддержания качества жизни женщинА.К. В попытке разработать нехимиотерапевтические средства восстановления и сохранения здоровья урогенитального тракта,применяли пробиотикотерапию с лактобациллами. Влагалище представляет собой своеобразную экологическую систему, которая тесно связана с внутренней средой организма и его внешним окружением. Неотъемлемой частью микроэкосистемы полости влагалища является нормальная микрофлора, которая рассматривается как первичная мишень для любого фактора, прямо или опосредованно влияющего на адгезию и неспецифическую резистентность этой экосистемы. Из-за широкого, бесконтрольного применения антибиотиков нарушается нормальный микробиоценоз влагалища, что является одной из ведущих причин развития урогенитальных заболеваний. Для восстановления нормофлоры наиболее эффективным действием обладают препараты естественного происхождения и одними из них являются пробиотики, в состав которых входят микроорганизмы - естественные обитатели влагалища женщин. В связи с вышеизложенным, разработка консорциума на основе молочнокислых бактерий-4,В-1 восстанавливающих нормальный биоценоз влагалища имеет важное значение при профилактике и лечении бактериального вагиноза. Полученный нами пробиотический консорциум предназначен для лечения и профилактики бактериального вагиноза. Выделение чистой культуры В качестве исходного материала для исследований были взяты мазки с заднего свода влагалища. Для выделения молочнокислых бактерий,исследуемые образцы засевались в обогащенные среды МРС-1 производства. . следующего состава пробы из жидкой среды высевали на плотные селективные среды МРС-4 производства.с компонентами (г/л) протеозопептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, мясной экстракт - 10, глюкоза - 20, твин-80 - 1, аммония цитрат - 2, натрия ацетат - 5, магния сульфат - 0,1,марганца сульфат - 0,05, натрия гидрофосфат - 2,агар-агар - 12,6,5. Также проводили дозированный посев на плотные среды МРС-4 из трех диагностически значимых разведений влагалищных мазков - из четвертого,пятого и шестого разведений. Все посевы инкубировали в термостате при 37 С в течение 48 часов в микроаэрофильных условиях. Выросшие колонии отсевали в пробирки со скошенной питательной средой МРС-4 и инкубировались при 37 С в течение 48 часов. Принадлежность выросших микроорганизмов к родуустанавливали на основе их микроскопии морфология клеток, подвижность,отсутствие или наличие спор, тинкториальные свойства наличие каталазы рост на питательном агаре. Идентификация выделенных культур Работа по видовой идентификации лактобактерий выделенных из влагалищного эпителия женщин репродуктивного возраста была проведена с помощью молекулярно-биологических методов на основе анализа гена 16 . Материалом для исследования служило вагинальное отделяемое из заднего свода влагалища. Из чистых культур лактобактерий выделяли геномную ДНК с набором для выделения. Полученная ДНК служила матрицей в реакции амплификации с использованием универсальных праймеров,комплементарных гену 16 . После очистки ампликонов проведено секвенирование для определения нуклеотидной последовательности. Видовую идентификацию лактобактерий определяли с помощью пакета программ 9.0( , США) и базы данных ,программы . Две культуры лактобактерий, выделенные от здоровых женщин и входящие в состав пробиотического консорциума генотипированы и представлены такими видами, каки. Последовательность фрагмента гена 16-4 длиной более 790 п.н.. Последовательность фрагмента гена 16-1 длиной более 730 п.н.. Технология получения консорциума Для получения консорциума использовали метод совместного культивирования двух активных штаммов лактобацилл 4,1. Из 24-часовых штаммов лактобацилл готовили культуральные взвеси по оптическому стандарту на 10 единиц и в равных соотношениях вносили в бульонную среду МРС-1. Инкубация производилась при 37 С в течение 48 часов. Для проверки качества полученного консорциума учитывали количество клеток микроорганизмов в 1 мл, а также были изучены адгезивная,антагонистическая активности,устойчивость к антибиотикам. Сравнивали полученные параметры консорциума с индивидуальными показателями составляющих компонентов. Для выявления биосовместимости культур лактобацилл в консорциуме был использован метод перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде (фиг.1). Для этого на агаризованную среду МРС-4 в чашке Петри высевались штрихом двухсуточные бульонные 3 культуры лактобацилл по диаметру чашки,инкубировали в течение 48 часов при 37 С. Затем,перпендикулярно к его штриху подсевали штрихами остальные исследуемые лактобациллы. Для посева использовались густые суспензии культур. Чашки выдерживали в термостате при 37 С в течение 48 часов. По активному и равномерному росту, отсутствию зон задержки роста микроорганизмов в области их соприкосновения, внешнему виду штаммов, который соответствовал культурам, был сделан вывод, что штаммы находятся в состоянии симбиоза, что позволяет нам рекомендовать их для совместного использования в консорциуме. Определение антагонистической активности Антагонистическую активность лактобацилл по отношению к тест- культурам, ,,,,изучали методом отсроченного антагонизма. С этой целью свежие культуры лактобацилл, выращенные в бульонной среде МРС-1, пересевали петлей методом укола на чашки Петри с агаризованной средой МРС 5. После 2-суточной инкубации при 37 С с целью уничтожения выросших культур чашку Петри выдерживали в парах хлороформа 30 мин.,проветривали 20 минут. Затем поверхность чашек заливали вторым тонким слоем расплавленной и остуженной до 46 С МРС-5, содержащей 0,7 агара и смешанной с взвесью индикаторной культуры (0,1 мл взвеси индикаторной культуры бактерий в мкр.кл./мл). Об концентрации 1109 антагонистической активности судили по зоне отсутствия роста тест-штаммов вокруг колонии испытуемого штамма лактобацилл. Антагонистическая активность исследованных культур считалась нулевой при ширине зоны отсутствия роста тест-штаммов до 1,0 мм, низкой при 1,1-4,9 мм, средней - при 5,0-8,9 мм, высокой при 9,0 мм и более. Полученный вариант консорциума из лактобактерий был исследован на антагонистическую активность. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Антагонистическая активность консорциума БВ-8 Название Диаметр зон подавления роста тест-культур, мм. Наименьшими показателями антагонистической активности монокультуры обладали к клиническому изоляту. При изучении антагонизма консорциума выявлено увеличение показателя в 1,5 раза. Определение адгезивной активности. Данное свойство было изучено с применением экспресс-метода определения адгезии к эритроцитам человека Брилис В.И Приготовление взвеси эритроцитов человека. Для получения взвеси эритроцитов человека берут 0 (1) группу крови, резус положительный, которую собирают в центрифужную пробирку с 0,5 цитратом натрия в соотношении крови и раствора 11. Затем пробирки центрифугируют при 1500 об/мин,надосадочную жидкость удаляют, а осадок эритроцитов отмывают физиологическим раствором. При этом к 1 объему осадка прибавляют 9-10 объемов стерильного физиологического раствора и центрифугируют в течении 3-5 минут при 1500 об/мин. Эту процедуру проводят трижды (до прозрачности надосадочной жидкости). После чего из осадка эритроцитов готовят необходимую взвесь. 1 каплю физиологического раствора наносили на предметное стекло, затем брали по одной петле взвеси эритроцитов и клеток культур и суспендировали в растворе. После чего предметное стекло помещали во влажную камеру при температуре 37 С на 30 мин., затем высушивали и фиксировали над пламенем горелки. После окраски по Романовскому - Гимзе его просматривали под световым микроскопом. Адгезивную активность 4 учитывали по среднему числу микробных клеток,прикрепившихся к эритроциту - средний показатель адгезии (СПА). Активность считают нулевой при СПА от 0 до 1,0, низкой - от 1,1 до 2,0, средней - от 2,01 до 4,0 и высокой свыше 4,0. Адгезивная активность у-4 составляет 18,67,31 - 4,70,9. По результатам изучения адгезивных свойств полученного консорциума БВ-8, он обладал высоким показателем и составил 10,4. Изучение устойчивости к антибиотикам Чувствительность выделенных культур к антибиотикам определяли методом стандартных дисков в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04,Москва, 2004 г.) Чувствительность определяли к 8 антибиотикам ампицилину,гентамицину,канамицину,ванкомицину,рокситромицину,амоксиклаву, клиндамицину, метронидазолу. Из чистых агаровых культур готовили суспензию,плотностью по стандарту мутности в 10 ЕД, затем полученную взвесь разводят повторно еще в 20 раз. В чашки Петри на поверхность агаризованной среды МРС-5 наносили 1 мл микробной суспензии и покачиванием равномерно ее распределяли, а избыток удаляли пипеткой. Чашки подсушивали при комнатной температуре 10-15 мин, стерильно раскладывали диски на поверхность среды не более 5-6 штук на одну чашку. Через сутки учитывали результаты путем измерения зоны задержки роста микроба, с учетом диаметра самого диска. По чувствительности бактерии были разделены на чувствительные,умеренно чувствительные и устойчивые. Результаты антибиотикорезистентности консорциума представлены в таблице 2. Таблица 2 Зоны задержки роста, мм Гента- РокситроКлиндамицин мицин мицин 10 Ко К 1 15 25 10 Консорциум БВ-8 обладает устойчивостью к метронидазолу, ванкомицину, канамицину. Методы длительного хранения лактобацилл Культуры лактобацилл, пассированные до 2-3 раз в бульонной среде МРС-1, выращивали на агаризованной среде МРС-4 в течение суток при 37 С. Выращенные культуры смывали стерильным обратом. Концентрированную суспензию бактерий(107-108 КОЕ/мл) разливали по 1,0 мл во флаконы и замораживали при -40 С в морозильнике в течение суток. Затем лиофилизировали на установке фирмыпод вакуумом при температуре -180 С в течение 12 часов по достижении остаточной влажности образцов не более 3. Полученные лиофилизированные культуры хранили в морозильнике. Остаточную влажность полученных лиофилизированных культур вычисляли по формуле 21100 1, где- вес пустого бюкса 1 вес с навеской материала 2 - вес после высушивания (1 час в сухожаровом шкафу при температуре 103-105 С) - остаточная влажность Показатели жизнеспособности культур лактобактерий после лиофилизированной сушки составили 5,21011 КОЕ/мл. Для криоконсервирования лактобацилл использовали криозащитную среду, состоящей из 20 глицерина, 10 сахарозы и 10 поливинил пирролидона, растворителем была среда МРС-1. Свежие культуры бактерий смывали криозащитной средой. Густые суспензии культур лактобацилл (109 Амоксиклав Ас 30 20 1010 клеток/мл) разливали по 1,0 мл в пластиковые ампулы с завинчивающими пробками. Замораживание производили в два этапа 5 часов при -17 С в холодильнике и затем в жидком азоте (150 С). Пробы хранили в низкотемпературном рефрежираторе при температуре -80 С. Таким образом, изобретение представляет способ получения пробиотического консорциума - БВ-8,состоящий из .-1 и .-4. Концентрация жизнеспособных культур лактобактерий после лиофилизированной сушки составляет 5,21011 КОЕ/мл., зоны угнетения роста тест-штаммов, мм Е.21,0 .15,0 .26,0 .20,0 .17,025,0. Обладает устойчивостью к канамицину, ванкомицину и к метронидазолу. Полученный консорциум БВ-8. состоящий из .-1 и .-4 позволяет применять в качестве основы пробиотического препарата для восстановления нормальной микрофлоры влагалища женщин. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Пробиотический консорциум БВ-8 на основе культур лактобактерий-4 и-1, депонированный в Республиканской коллекции микроорганизмов РГП НЦБ РК КН МОН РК,регистрационным номером- 0282, для использования в качестве основы бактериального препарата для профилактики и лечения дисбактериозов влагалища женщин