Консорциум бактериальных культур БП-3 (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Bifidobakterium bifidum) для приготовления йогурта

(51) 12 1/20 (2010.01) 12 1/16 (2010.01) 23 9/123 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к пищевой биотехнологии, молочной промышленности и предназначено в качестве основы закваски прямого внесения для производства йогурта. Задачей изобретения являлось создание пробиотического консорциума на основе выделенных молочнокислых бактерий. Для создания консорциума,перспективного для производства йогурта, отобраны 4 штамма,обладающих высокой биологической активностью, . Полученный консорциум характеризуются хорошими органолептическими свойствами и высокой скоростью прироста биомассы в процессе ферментации молока, что дает возможность использовать его в качестве основы закваски прямого внесения, для производства функциональной кисломолочной продукции с органолептикой йогурта в промышленных объемах.(72) Уразова Майра Салаватовна Туякова Алтынай Камидоллаевна Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна Шахабаева Гульнара Сакеновна Абжалелов Ахан Бегманович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) КОНСОРЦИУМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР БП-3 ( ,24263 Изобретение относится к пищевой биотехнологии, молочной промышленности и предназначено в качестве основы заквасок прямого внесения для производства йогурта. Изобретение представляет пробиотический консорциум, перспективный в качестве основы заквасок прямого внесения для промышленного производства функциональных кисломолочных продуктов Аналог изобретения. Наиболее близким к заявляемому препарату является Бифилакт(Голенский В.П., Солодухина Л.И., 2001, патент Российской Федерации 2163128). Бифилакт вырабатывают из стерильного коровьего молока,путм сквашивания его одним из штаммов бифидобактерий (. 1, В.791), в сочетании с одним штаммом лактобактерий(296,904). Кисломолочный бифилакт обладает высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микробам, антиаллергической,антиопухолевой активностью,разрешен к применению людям любого возраста, при дисбиозах различного происхождения. Задача изобретения - создание коллекции молочнокислых бактерий,выделенных из кисломолочной продукции и биотопов здорового человека скрининг культур, создание консорциумов,на основе выделенных молочнокислых бактерий, и дальнейшее их обогащение культурой бифидобактерий для повышения пробиотических свойств стабилизация органолептических и технологических свойств обогащенных консорциумов, а также,изучение их биологических свойств. Технический результат изобретения разработанный консорциум БП-3 имеет кардинально новую цель и предназначается, в основном, для производства функционального продукта питания с органолептикой йогурта в промышленных объемах,он является основой заквасок прямого внесения. Для составления консорциума были использованы высокоактивные штаммы,выделенные из традиционных кисломолочных продуктов домашнего приготовления различных регионов Республики Казахстан, что также положительно сказывается на эффективности БП-3, в качестве терапевтического средства для профилактики и лечения дисбиотических состояний населения Казахстана. Продукт Бифилакт является отдельным продуктом,со специфическими органолептическими показателями, его выпускают малыми партиями,получившие разрешение на его производство предприятия Российской Федерации. Достижения технического результата позволяют создать пробиотический консорциум лактобактерий и на его основе создать закваску прямого внесения для промышленного производства кисломолочного продукта. Составление консорциумов. В результате выделенные и отобранные нами культуры молочнокислых бактерий в полной мере удовлетворяли требованиям, предъявляемым к заквасочным культурам,и было решено использовать их в качестве компонентов пробиотических консорциумов для получения функциональных продуктов питания. Устойчивого состояния смешанной культуры добивались применением метода полунепрерывного культивирования. Для этого в пробирки со стерильным обезжиренным молоком вносили по 0,1 мл наших культур в комбинациях,,и помещали их в термостат при температуре 37 С. Через каждые 12 часов микроорганизмы пересевали на свежую среду и культивировали в тех же условиях. В сквашенных образцах определяли кислотность по Тернеру, ароматообразование. Микробиологический контроль проводили путем микроскопирования и высева на твердую питательную среду с последующим подсчетом числа клеток. Пересевы продолжали до наступления устойчивого соотношения клеток микроорганизмов,составляющих ассоциацию. Количественный учет клеток производили микроскопированием. Обогащение полученных консорциумов культурой. Для обогащения консорциумов была выбрана культура бифидобактерий,обладающая широким спектром антагонистической активности в отношении патогенной и условнопатогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. Перед тем как внести культурув ассоциацию с нашими консорциумами, мы проверили их на проявление антагонистических свойств по отношению друг к другу, для проведения этого эксперимента был предпочтен метод отсроченного антагонизма. Методом укола на чашки Петри с агаризованной средой МРС-5 была посажена трехсуточная культура, затем ее инкубировали при 37 С 2 суток,после чего поверхность чашек заливали расплавленной и остуженной до 46 С средой МРС 5, содержащей культуры консорциумов. Затем чашки снова инкубировали при 37 С 2 суток. Соотношение культур в комбинированной закваске выбирали с учетом сбалансированного роста, вязкости продукта и органолептических показателей. Было выявлено, что соотношение 11(культуры консорциумов) является наиболее выгодным, как в плане проявления сенсорных характеристик конечного продукта,сохранения активности кислотообразования на начальном уровне, не превышающем 8 часов, в зависимости от комбинации,а также количественного. Органолептические показатели,снятые с продуктов, полученных путем сквашивания молока обогащеннымиконсорциумами, полностью удовлетворяли запросам требуемой кисломолочной продукции (кислотность не превышала среднюю 80 Т, вкус, цвет и запах соответствовали ряженке). 24263 Биологические свойства консорциумов,обогащенных культурой бифидобактерий. Антагонистическая активность консорциумов в отношении патогенных микроорганизмов. Полученные в ходе эксперимента результаты говорили о высокой антагонистической активности консорциумов по отношению к тест-штаммам, и о том, что в консорциуме данное свойство выражалось намного сильнее в сравнении с отдельно взятыми культурами. Антагонистическая активность консорциумов превышала таковую культуры. Максимальные показатели антагонистической активности были выявлены у консорциума БП-2 41,61,52 мм 31,01,0 мм -23,31,15 мм -33,60,58 мм -32,30,57 мм 24,60,58 мм -26,30,57 мм -30,830,76 мм -. Определение активности гидролиз Оценка активности гидролитических ферментов,секретируемых культурами консорциумов, показала,что они способны расщеплять гликозидные связи в молекулах декстрана, растворимого крахмала и целлобиозы. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 амилаза декстраназа целлобиаза амилаза декстраназа целлобиаза Активность гидролитических ферментов Содержание определяемого фермента в параллельных определениях, ед/мл 1 2 0,11 0,11 0,09 0,09 0,15 0,15 0,0085 0,0087 0,94 0,92 70,98 71,04 Получение биомассы культур консорциумов Скорость наращивания биомассы является одним из основных показателей качества заквасочных культур. Определение данной характеристики мы осуществляли посредством применения метода определения способности бактерий восстанавливать метиленовую синь. Для чего к 10 мл. стерильного обезжиренного молока с 0,1 метиленовой сини добавляли 0,1 мл исследуемой культуры. После чего содержимое пробирки тщательно перемешивали и выдерживали при 37 С,наблюдая за восстановлением индикатора. Редукция индикатора наблюдалась во всех пробирках с обогащенными консорциумами через 46 часов, что указывало на хорошую способность наших культур наращивать биомассу. Восстановления окраски после не наблюдалось, что также являлось хорошим показателем, так как,свидетельствовало об отсутствии в заквасках бактериофага, как нежелательного агента. Проверка на наличие бактериофагов осуществлялась нами постоянно,через определенный промежуток времени. Результаты всегда были отрицательными, что говорит о хорошем качестве заквасочных культур и о возможности применения их в производстве кисломолочной продукции на промышленных предприятиях. Устойчивость культур консорциумов к различным концентрациям желчи, желудочного сока и . Устойчивость к желчи определяли по способности бактерий расти в присутствии различных концентраций желчи (20,30,40), для чего в среду МРС-1 вносили стерильно желчь крупного рогатого скота (ООО Самсон-мед,Россия). После этого в пробирки переносили петлей исследуемую культуру и инкубировали в течение 48 часов при 37 С. Рост микроорганизмов отмечали наличием мутности в среде и микроскопированием. Аналогично определяют устойчивость микроорганизмов к желудочному соку, но уже вместо желчи в МРС-1 вносят различные концентрации (20, 30, 40) желудочного сока. При определении устойчивости молочнокислых бактерий к поваренной соли, берут 2,4 и 6 концентрации , которые также разводят в среде МРС-1. В том и другом случае о росте судят по наличию мутности в среде после инкубации и по микроскопированию мазков. Результаты приведены в таблице 2. Таблица 2 Устойчивость консорциума к различным концентрациям желчи фактор КонцентрацияБП-3 Желчь 20 Результаты показали устойчивость консорциума к 20 желчи. При исследовании адаптации культур консорциума к воздействию осмотического стресса,было выявлено, что консорциум обладают способностью расти в возрастающих концентрациях . Разработка консорциумов на основе молочнокислых бактерий для получения кисломолочных продуктов (йогурта). Скрининг культур с учетом активности ферментации, энергии кислотообразования и пробиотических характеристик. Консорциумы для бактериальных заквасок кисломолочных продуктов, были составлены нами,в соответствии с основными принципами производства кисломолочных продуктов,используемых в мировой практике. Было решено получить консорциумы,обеспечивающие ферментацию молока с образованием продукта с органолептикой ряженки. В собранной нами коллекции молочнокислых бактерий видпредставлен 4 культурами (М-001, 040, 073,106),- 6 культурами (М-002, 026, 042, 074, 093,104),.- 3 культурами (076, 102, 114). В результате при оценке таких параметров как активность кислотообразования и энергия кислотообразования, были отобраны 3 наиболее активных по проявлению данных характеристик и параметров штамма. Ими стали М-073 Таблица 3 Показатели активности и энергии кислотообразования, а также органолептические свойства культур,проявленные ими в процессе ферментации молока. Культуры Текстуральные свойства конечного продукта ферментации 3 Был выделен из кефира, при сквашивании молока дает жидкую текстуру Был выделен из мягкого сыра, при сквашивании молока дает однородную полужидкую текстуру Сквашивание слабое,консистенция полужидкая,вязкости нет Сквашивание хорошее,консистенция густая,вязкость хорошая Сквашивание хорошее,консистенция не сильно густая, вязкость слабая Сквашивание хорошее,очень густая консистенция,вязкость низкая Низкий уровень сквашивания,вязкость средняя Сквашивание отличное,консистенция густая,вязкость хорошая Низкий уровень сквашивания,вязкость средняя Органолептические свойства продукта ферментации Цвет молочный, вкус приятный,кисловатый, близкий к ряженке,запах кисломолочный Цвет белый, молочный, вкус приятный,кефирный,запах кисломолочный Аромат молочный, цвет молочнобелый, вкус кислит, но приятный близкий к йогурту Цвет молочный, белый, запах 3-3,5 приятный с кислинкой, вкус не сильно кислый близкий к йогурту Цвет молочный, запах приятный 6 молочный, вкус кисловатый Цвет молочный, белый, запах 7 приятный с кислинкой, вкус не сильно кислый близкий к йогурту Цвет молочный, запах приятный 4,5-5 молочный, вкус кисловатый Отобранные нами культуры молочнокислых бактерий про ферментации молока образовывали продукты с хорошими органолептическими и текстуральными характеристиками. Но, что более важно, они показали высокую активность ферментации, т.е. образование первого сгустка,которое определялось наименьшим отрезком времени (от 3 до 4 часов). Антагонистическая активность была определена к следующим тест-штаммам,,,, ,,,, представителям условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ человека. Степень антагонизма определялась по ширине зон угнетения роста тест-штаммов культурами молочнокислых бактерий, методом отсроченного антагонизма. Результаты экспериментов представлены в диаграммах (фиг. 1, 2, 3, 4). Большинство культур показали среднее значение антагонистической активности к тест-штаммам .и .ширина зон подавления роста не превышала 9 мм. Высокую степень антагонизма проявили лишь культуры . По отношению к тест-штаммам .и .также в большинстве случаев была отмечена средняя степень антогонистической активности. Исключение составили . М-040 (9,70,47 и 11,080,8, соответственно), .М-102 (12,330,57 к . о) и . М-0264 М-042 Наименьшие показатели антагонистической активности практически у всех культур были отмечены к тест-штамму С. , а у-114,. М-074 и М-093 она полностью отсутствовала (0). Только одна культура. -002 подавляла рост данного тестштамма с активностью выше средней (10,01 мм). По отношению к. показатели антагонизма были выше среднего лишь у 2 культур К тест-штаммам . и . высокие показатели антагонистической активности показали соответственно) и М-073 (9,70,57 и 121,0). Низкая активность зарегистрирована у . -106(1 и 2), . М-114 (3 и 4) и . М 074 (1,00 и 3,00) и М-093 (1,660,57 и 3,00 мм). Таким образом, высокой антагонистической активностью в целом обладают культуры(15,50,5 мм к .). Слабыми антагонистами по отношению к ряду патогенов являются. у ряда культур антагонистическая активность не была выявлена. К основным критериям отбора пробиотических штаммов микроорганизмов, помимо высокой степени антагонизма,относится также резистентность к воздействиям факторов внутренней среды организма человека, а также их способность к адгезии на кишечном эпителии. Поэтому была изучена устойчивость молочнокислых культур к различным концентрациям желудочного сока,желчи,хлористого натрия и их адгезивная активность. Также были оценены такие параметры как скорость прироста биомассы методом восстановления метиленовой сини и наличие бактериофага. Принимая в расчет все параметры и основываясь на полученных данных, можно заключить, что штаммы . -073, . М-102 и-042 являются наиболее предпочтительными в качестве стартерных культур заквасок прямого внесения для производства функциональной кисломолочной продукции. Они обладают высокими показателями активности ферментации (3,5-4 часа), скорости прироста биомассы культур(3-4 часа),сильными антагонистическими, адгезивными свойствами,устойчивостью к высоким концентрациям желчи,желудочного сока и хлористого натрия. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум бактериальных культур БП-3