Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием искусственного трансляционного энхансера

(51) 12 15/00 (2010.01) 12 15/67 (2010.01) 12 15/09 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии растений, генной инженерии и молекулярной биологии растений. Достигаемый технический результат упрощение и удешевление процедуры конструирования рекомбинантных кассет нуклеиновых кислот,предназначенных для эффективной экспрессии генов в растительных системахи. Предлагается при конструировании рекомбинантных кассет, использующихся для экспрессии генов в растительных системахи, помещать перед кодирующей областью гена нуклеотидную последовательность 115105(53) для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Данная нуклеотидная последовательность,находясь в 5-нетранслируемой последовательности рекомбинантной мРНК, способна повышать уровень ее экспрессии в 7,3 раза.(72) Искаков Булат Кудайбергенович Акбергенов Рашид Жагупарович Жаныбекова Сауле Шангереевна Жигайлов Андрей Викторович Полимбетова Найля Сейтжановна Бисенбаев Амангельды Куанбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. Аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИСКУССТВЕННОГО ТРАНСЛЯЦИОННОГО ЭНХАНСЕРА Изобретение относится к области биотехнологии растений, генной инженерии и молекулярной биологии растений. Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена трансляционного энхансера, представляющего собой 5-концевой фрагмент геномной РНК вируса желтой карликовости ячменя( ,5910628,- 1999-06-08). Данный способ имеет ряд недостатков 1) использование энхансера вирусного происхождения сравнительно большого размера (168 нуклеотидов 5-НТП вирусной РНК и еще 27 нуклеотидов кодирующей области) существенно осложняет и удорожает его синтез 2) необходимость использования в качестве энхансера участка кодирующей области вирусного гена приводит к изменению аминокислотной последовательности рекомбинантного белка (к -концу белка добавляются лишние 9 остатков аминокислот), что может повлиять на свойства синтезируемого рекомбинантного белка 3) низкая энхансерная активность используемой регуляторной последовательности и 4) зависимость работы трансляционного энхансера от наличия в составе мРНК 3-НТП геномной РНК . Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена природных трансляционных энхансеров вирусного происхождения ( , 5612193,- 1997-03-18). Данный способ заключается в помещении в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена 5-некодирующие последовательности (5-НТП) геномных РНК вируса табачной мозаики , вируса желтой мозаики турнепса , вируса мозаики костраи вируса мозаики люцерныс целью повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Данные нуклеотидные последовательности синтезируются либо, либо с использованием метода обратной транскрипции с использованием геномных РНК соответствующих вирусов в качестве матрицы. Первым недостатком описанного способа является использование в качестве трансляционных энхансеров нуклеотидных последовательностей вирусного происхождения. Известно,что встраивание в растения участков вирусных геномов может сопровождаться риском раковой трансформации растительных клеток (Пирузяп Э.С.,Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. - М. Наука, 1985. -с. 195). Вторым недостатком описанного способа является дороговизна и техническая сложность синтеза использующихся в данном способе вирусных последовательностей. Это связано с достаточно большими их размерами. Так, 5-НТП 2 РНК 4 составляет 345 нуклеотидов, 5-НТП геномной РНК- 69 нуклеотидов, 5-НТП геномной РНК- 87 нуклеотидов, 5-НТП РНКЗ- 91 нуклеотид. Большой размер этих 5 НТП также способствует уменьшению полезной емкости векторов увеличение размеров некодирующих районов должно вести к сокращению размера кодирующей области рекомбинантного гена. Третьим недостатком описанного способа является то обстоятельство,что все использующиеся в нем 5-НТП вирусные РНК способны эффективно работать лишь в том случае,если в 3-нетранслируемых последовательностях (3 НТП) репортерной РНК будет находиться 3-НТП соответствующей вирусной РНК. Зависимость энхансерных свойствописанных 5-НТП вирусных РНК от строго определенных 3-НТП и невозможность унификации нуклеотидной последовательности 3-НТП,существенно затрудняет процесс конструирования рекомбинантных кассет нуклеиновых кислот. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием искусственного трансляционного энхансера для упрощения и удешевления процедуры конструирования рекомбинантных кассет нуклеиновых кислот,предназначенных для эффективной экспрессии генов в растительных системахи. Задача достигается предлагаемым способом повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием искусственного трансляционного энхансера,включающий помещение трансляционного энхансера в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена, но, в отличие от известного способа, в качестве трансляционного энхансера используют нуклеотидную последовательность 115105(53). Сущностью изобретения является использование в качестве трансляционного энхансера нуклеотидной последовательности 115105(53), которую помещают в 5-НТП мРНК-конструкций непосредственно перед кодирующей областью рекомбинантного гена для повышения уровня его экспрессии в растительных системах. Эта последовательность комплементарна участку 11031122 центрального района 18 рРНК растений (для. -нуклеотиды 1099-1123). Нуклеотидная последовательность 115105 обладает энхансерными свойствами при ее помещении в 5-НТП рекомбинантных РНКконструкций. Возможный механизм усиления последовательностью 115105 трансляции мРНК может быть опосредован ее связыванием с 18 рРНК в составе 40 доступен в составе 40 рибосомных субчастиц растений для комплементарных взаимодействий с другими молекулами нуклеиновых кислот (Жигайлов А.В., 24264 Грайфер Д.М., Лалетина Е.С., Полимбетова Н.С.,Искаков Б.К. Центральный домен 18 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц растений экспонирован для комплементарных взаимодействий//Биотехнология Теория и практика.- 2008. -1.- с. 42-49). Также установлена его важная роль в процессе трансляции мРНК(Жигайлов А.В., Ережепов Д.А., Акбергенов Р.Ж.,Искаков Б.К. Изучение способности 5-концевого домена геномной РНК сателлитного вируса некроза табака повышать эффективность трансляции // Вестник КазНУ. Сер. биол. - 2004. - Т.22. -1. - с . 40-43) и высокая консервативность этого района 18 рРНК у растений . Поэтому нуклеотидная последовательность 115105, в силу своей комплементарности к центральному району 18 рРНК растений, должна напрямую связываться с 1 8 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц, привлекая к мРНК дополнительное количество рибосомных субчастиц и повышая, таким образом, уровень их трансляции. Нуклеотидная последовательность 115105 не является участком генома какого-либо вируса, ее размер составляет всего 20 нуклеотидов, а энхансерные свойства не зависят от конкретной 3 НТП. Эти свойства трансляционного энхансера 115105 позволяют существенно упростить и удешевить процедуру получения рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот, предназначенных для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах. ДНК-фрагмент, содержащий в своем составе последовательность 115105, может быть синтезировани встроен по сайтам рестрикции перед кодирующей областью различных рекомбинантных генов в ДНК-конструкции,позволяющие осуществлять экспрессию рекомбинантных геновидля повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Пример 1. В качестве примера приводится способ клонирования последовательности 115105 перед репортерным геном ,кодирующим из, и оценки энхансерного эффекта этой регуляторной последовательностив бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Для встраивания последовательности 115105 в ДНК-конструкцию - (созданную на основе векторасодержащую промотор бактериофага Т 7, линкерный участок, включающий сайты рестрикции ,и , репортерный гени 3-НТП геномной РНК ) по сайтам рестрикциии , синтезируют два олигодезоксирибонуклеотида 1) 5 АААС-3 и 2) 5-С-3(нуклеотиды, формирующие сайты рестрикции,обозначены курсивом, а нуклеотиды, формирующие последовательность 115105, подчеркнуты). Проводят отжиг этих двух олигонуклеотидов при температуре 96 С в течение 2 минут с последующим постепенным охлаждением до комнатной 3 температуры. При этом образуется следующий ДНК-фрагмент 5 335 5-концы полученного ДНК-фрагмента фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 50 мкл,содержит 100 мМ трис-(рН 8,0), 5 мМ ДТТ, 10 мМ 2, 0,05 мМ АТР, 20 единиц полинуклеотидкиназы фага Т 4 и 0,5 мкмоль описанного выше ДНК-фрагмента. Реакцию проводят при температуре 37 С в течение 30 минут. После окончания инкубации реакционную смесь депротеинизируют смесью фенолхлороформ в соотношении 11. Для осаждения фосфорилированного ДНК-фрагмента к водной фазе прибавляют 0,8 объемов изопропанола, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугируют на 20000 при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадок промывают 70 этанолом, сушат на воздухе и растворяют в 20 мкл стерильной бидистиллированной воды. Лигирование фосфорилированного ДНКфрагмента,содержащего в своем составе последовательность 115105 с векторной ДНК , обработанной рестриктазамии ,проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит 66 мМ трис-НС 1 (рН 7,6), 6,6 мМ 2, 10 мМ ДТТ, 0,066 мМ АТР, 100 нг векторной ДНК, 50 нг вставки и 1 ед. Т 4 ДНК-лигазы. Инкубацию проводят при температуре 12 С в течение 12 часов. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток бактерий Е.штамма -1,которые затем высаживают на твердую питательную среду Лурия-Бертани,содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Проводят скрининг колоний. Выделяют из бактерий ДНКконструкцию р (115 105)-. РНК-конструкцию (115105)- получают методом транскрипции, используя в качестве матрицы ДНК-конструкцию р(115105)-,обработанную рестриктазой . Реакционная смесь объемом 50 мкл содержит 250 мМ (рН 7,5), 30 мМ 2, 40 мМ ДТТ, 2 мМ спермина,по 7 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 50 ед. ингибитора рибонуклеаз (РНКзина), 30 ед. РНК-полимеразы фага Т 7 и 2 мкг линеаризованной ДНК-матрицы. Реакционную смесь инкубируют при температуре 37 С в течение 2 часов. По окончании инкубации смесь депротеинизируют хлороформом. После центрифугирования при 10000 в течение 10 минут к водной фазе прибавляютдо конечной концентрации 3 М и инкубируют при температуре 4 С в течение 30 минут. После центрифугирования при 10000 в течение 30 минут осадок промывают 70 этанолом, сушат на воздухе и растворяют в 20 мкл бидистиллированной воды. Реакционная смесь для проведения трансляцииобъемом 25 мкл содержит следующие компоненты 20 мМ трис-Ас (рН 7,6), 90 мМ КОАс, 24264, 10 мМ креатинфосфата, 0,12 мг/мл креатинфосфаткиназы, 0,1 мМ спермидина, по 0,1 мМ аминокислот, 2 мкг соответствующей РНКконструкции и 1 1 мкл бесклеточного экстракта из зародышей элитной яровой пшеницы (.) сорта Казахстанская 4. Реакционные смеси инкубируют при 26 С. Эффективность трансляции определяют флюорометрически по активности фермента(который являлся продуктом трансляции). Для этого после окончания инкубации к 1 0 мкл трансляционной смеси прибавляют 20 мкл экстракционного буферного(МЭТ), 0,1 саркозила и 0,1 тритона Х-100. Смесь инкубируют 30 минут при 37 С. После этого образцы охлаждают до 0 С и прибавляют 30 мкл холодного раствора субстрата (1 мг/мл 4 метилумбелиферилглюкуронида в экстракционном буфере). Инкубируют при 37 С в течение 5 минут. Реакцию останавливают охлаждением реакционной смеси до 0 С. К 20 мкл смеси прибавляют 2 мл 0,2 М раствора 2 СО 3 и замеряют флюоресценцию при 455 нм, используя возбуждающий свет с длиной волны 365 нм. Таблица 1 Эффективность трансляции контрольной РНК-конструкции - и РНК-конструкции (115105)- в бесклеточной системе из зародышей пшеницы РНК-конструкция(115105)73055 Примечания 1 значения- активности представлены в виде Хср, где Хср - значение среднего арифметического,- ошибка среднего арифметического 2 Достоверность различий определялась по критерию Стьюдентав сравнении с контролем составила 1,5910-6. Таким образом, при помещении данной нуклеотидной последовательности в 5-НТП рекомбинантных РНК-конструкций эффективность экспрессии репортерного гена увеличивается по сравнению с РНК-конструкциями, не содержащими в своих 5-НТП энхансерных последовательностей в несколько раз (в бесклеточной системе из зародышей пшеницы - в 7,3 раза). Использование последовательности 115105 вместо природных трансляционных энхансеров вирусного происхождения позволяет существенно упростить и удешевить процедуру получения рекомбинантных ДНК-конструкций для экспрессии целевых генов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием искусственного трансляционного энхансера,включающий помещение трансляционного энхансера в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена, отличающийся тем,что в качестве трансляционного энхансера используют нуклеотидную последовательность 115105 (53).