Консорциум микроорганизмов Lactobacillus paracasei 127, Lactobacillus helveticus 4Ш1, Lactobacillus pontis 9K3, Lactobacillus paracasei 129. Saccharomyces cerevisiae A-28 используемый для приготовлеия препарата пробиотического действия

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/16 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН-28 ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕИЯ ПРЕПАРАТА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ(57) Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технологии получения препаратов пробиотического действия,биологически активных добавок, продуктов питания и может быть использовано в пищевой промышленности и ветеринарии для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, сельскохозяйственных животных и птиц.(72) Дудикова Галина Николаевна Чижаева Анна Викторовна Титова Ираида Владимировна Амангелд Алма Аманосызы Велямов Масимжан Турсунович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности Изобретение относится к области биотехнологии,в частности к технологии получения препаратов пробиотического действия, биологически активных добавок, продуктов питания и может быть использовано в пищевой промышленности и ветеринарии для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека,сельскохозяйственных животных и птиц. Известен консорциум штаммов молочнокислых и бифидобактерийКМ-2,КН-1,-1,используемые для приготовления биологически активных добавок и заквасок для производства кисломолочных продуктов. Консорциум обладает высокой активностью в отношении патогенов и устойчивостью к антибиотикам, что позволяет его использовать для приготовления пробиотиков и биологически активных добавок. При совместном культивировании названных микроорганизмов проявляется синергический эффект(Инновационный патент РК 25088 опубл. 14.04.2011 г.). Другим наиболее близким техническим решением - прототипом - является консорциум микроорганизмовВ-400,В-401,-402,используемый для производства кисломолочных напитков (Инновационный патент РК 26077 опубл. 14.09.2012 г.) Штаммы, входящие в состав консорциума, обладают высокой кислотообразующей активностью, биохимической и антагонистической активностью. Микроорганизмы были выделены из национального кисломолочного напитка - шубата и депонированы в коллекцию микроорганизмов Казахского НИИ перерабатывающей и пищевой промышленности. Задачей настоящего изобретения является разработка консорциума микроорганизмов пробиотического действия, используемого для приготовления бактериальных препаратов и биологически активных добавок для комбикормов. Качество пробиотических препаратов во многом обусловлено свойствами штаммов, используемых в качестве стартовых культур для приготовления препарата - их специфической активностью и технологичностью. Использование полиштаммовых композиций позволяет суммировать полезные свойства,присущие отдельным штаммам микроорганизмов. Это делает возможным разработку продуктов профилактического действия,способных обеспечить высокую колонизационную резистентность организма человека и сельскохозяйственных животных, восстанавливать нарушенную микрофлору и способствовать снижению заболеваемости. Консорциум должен содержать безопасные,совместимые микроорганизмы, при совместном культивировании имеющие высокий суммарный титр, обеспечивающие его устойчивость при длительном хранении и многократном пассировании. При использовании заявленного консорциума в качестве пробиотического препарата, полученный продукт должен иметь стабилизированные свойства,содержать живые пробиотические микроорганизмы в высоком титре продолжительное время, а также иметь продолжительный срок хранения. Поставленная задача решается описываемым консорциумом микроорганизмов, созданным из следующих штаммов 127(КазНИИПППВ-319),4 Ш 1(КазНИИПППВ-400),9 КЗ (КазНИИППП В-426),129 (КазНИИППП В-302).А-28 (КазНИИППП-8) используемый для приготовления препарата пробиотического действия. Микроорганизмы были выделены из зерновых субстратов и молочных продуктов (кумыса и шубата),и депонированы в коллекцию микроорганизмов Казахского НИИ перерабатывающей и пищевой промышленности(КазНИИППП). Имеется заключение ТОО Нутритест (учредитель АО Казахская академия питания) о безопасности и безвредности этих культур. В результате экспериментов по конструированию комбинированного пробиотика был создан консорциум,обладающий пробиотическим действием и депонирован в коллекцию микроорганизмов КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности за В-482. Консорциум содержит молочнокислые бактерии 127,4 Ш 1,93,129 и дрожжи-28. Штаммы микроорганизмов, входящие в состав консорциума, не являются антагонистистами в отношении друг друга, что позволяет их совместно культивировать. Изобретение позволяет получить консорциум с устойчивым соотношением культур, высокими титром клеток,титруемой кислотностью,антагонистической активностью в получаемом препарате. Предлагаемый консорциум обладает высокой активностью в отношении патогенов и устоойчивостью к антибиотикам, что позволяет его использовать для приготовления пробиотиков и биологически активных добавок. Нами было установлено, что при совместном культивировании описанных выше микроорганизмов проявляется синергический эффект. Штаммы 127,-28 входящие в состав консорциума, обладают высокой кислотообразующей активностью,биохимической и антагонической активностью, т.е. способностью подавлять возбудителей кишечных заболеваний, что гарантирует подавление в кишечнике патогенных микроорганизмов и нормализацию его микрофлоры. Устойчивость к антибиотикам характеризует способность выживать и развиваться в кишечнике человека на фоне антибиотикотерапии. Эти штаммы отбирались путем скрининга культур молочнокислых бактерий и дрожжей по параметрам культивирования заквасок на среде МРС таких как антагонистическая активность,энергия кислотообразования, накопление биомассы и белка,устойчивость к антибиотикам. В процессе длительной селекционной работы нами был получен консорциум микроорганизмов, обладающий следующими микробиологическими и биохимическими показателями 1. При росте на среде МРС имеет высокий суммарный титр (не менее 1012 КОЕ/г). 2. При пересевах на питательной среде МРС консорциум способен сохранять свои свойства не менее 10 пассажей. 3. Консорциум обладает более высоким антагонистическим свойством по сравнению с антагонизмом каждого штамма - зоны угнетения роста В.20 мм (таблица 1). Таблица 1 Антагонистические свойства консорциума Наименование микроорганизмов 1274 Ш 193129-28 Консорциум 4. ДрожжиА-28 входящие в консорциум, повышают питательную ценность пробиотического препарата, накапливая Зона подавления роста В. , мм 181,2 201,1 151,0 181,2 0 200,86 больше биомассы - 22 г/л и 33,19 белка при совместном культивировании с молочнокислыми бактериями (таблица 2). Таблица 2 физиолого-биохимическая характеристика консорциума Показатели культивирования Титруемая кислотность,Н Активная кислотность, рН Антогонистическая активность, диаметр зоны подавления роста В. , мм Белок,Культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки микроорганизмов,входящих в состав консорциума Штамм 127, выделен из зерна пшеницы. Клетки в виде коротких палочек размером 2-30,1 мкм, расположенные одиночно или цепочками. Продукт,синтезируемый штаммом ,- молочная кислота. Среда для культивирования - МРС, молочный гидролизат агаризованный. Дополнительная информация аэротолерантный анаэроб, штамм обладает высокой кислотообразующей способностью и антагонистической активностью по отношению к спорообразующей микрофлоре муки. Зона подавления роста В.181,2 мм. Устойчив к канамицину,ванкомицину,линкомицину,цефлоксацину. Штамм 4 Ш 1 выделен из шубата. Палочки размером 4-6 мкм, расположены попарно или короткими цепочками, неподвижные,спор не образует. На поверхности МРС- агара культура образует гладкие беловатые колонии круглой формы диаметром 2-3 мм. При глубинном выращивании образует колонии в виде комочков ваты. Продукт, синтезируемый штаммом молочная Характеристика консорциума 200,92 4,960,19 200,86 33,19 кислота. Титруемая кислотность 22 Н, зона протеолиза на молочном агаре 41 мм зона подавления роста В.составляет 201,6 мм. Среда для культивирования - МРС, молочный гидролизат агаризованный, обезжиренное молоко. Устойчив к ципрофлоксацину, олеандомицину,ампициллину, эритромицину, устойчив к 40 желчи. Штамм 9 К 3 выделен из кумыса. Палочки размером 3-4 мкм, одиночные и расположены попарно, короткими цепочками,неподвижные, спор не образует. На поверхности МРС-агара культура образует гладкие беловатые колонии круглой формы диаметром 2-3 мм. При глубинном выращивании образует лодочкообразные колонии в толще среды, на дне - колонии в виде комочков ваты. Продукт, синтезируемый штаммом молочная кислота. Титруемая кислотность 16,5 Н,зона подавления роста В.составляет 151,0 мм. Устойчив к канамицину, ванкомицину,цефлоксацину, устойчив к 40 желчи. Штамм 129 выделен из зерна пшеницы. Палочки размером 3-5 мкм,расположены попарно, короткими цепочками,неподвижные, спор не образуют. На поверхности 3 агара с гидролизованным молоком культура образует гладкие беловатые колонии -формы диаметром 2-3 мм. При глубинном выращивании образует лодочкообразные колонии. Продукт,синтезируемый штаммом ,- молочная кислота. Высокая кислотообразующая и антагонистическая активность,способность синтезировать бактериоцины. Среда для культивирования - МРС,молочный гидролизат агаризованный. Устойчив к канамицину,гентомицину,ванкомицину,фуразолидону. Штамм А-28 используется в хлебопекарном производстве. Форма клеток круглая. Размер клеток 11,0-6,98,0-5,5 мкм. Колонии на сусло-агаре круглые, гладкие,выпуклые, с тускло-блестящей поверхностью,белого цвета с кремовым оттенком. Продукт,синтезируемый штаммом - молочная кислота,уксусная кислота. Среда для культивирования неохмеленное сусло,сусло-агар,меласса. Дополнительная информация устойчив к высоким концентрациям мелассы, к посторонней микрофлоре-бактериям и дрожжеподобным грибам, а также к нитритам в концентрации 0,005, фагоустойчив. Культуры консорциума сохраняются в лиофилизированном виде в ампулах при минус 302 С и под вазелиновым маслом в пробирках. Пример использования консорциума для приготовления препарата пробиотического действия Получение консорциума осуществляется в два этапа 1. Приготовление жидкой биомассы консорциума. Чистые культуры 127,4 Ш 1,93,129 и-28 в соотношении 11111 вносим в питательную среду МРС. Термостатируем при температуре 312 С в течение 24 часов до титруемой кислотности 20 град Неймана. Полученный консорциум используется для приготовления пробиотического препарата. 2. Приготовление пробиотического препарата Пробиотический препарат получают путем смешивания 25 мл жидкой биомассы консорциума с 500 мл мучной питательной среды, которая ставится в термостат для заквашивания при температуре 312 С на 24 часа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум микроорганизмов 127,4 Ш 1,93,129,-28, депонированный в КазНИИППП под номером В-482, используемый для приготовления препарата пробиотического действия.