Популяционноустойчивый консорциум молочнокислых бактерий Lactococcus lactis K-1, Streptococcus termophilus K-2, Lactobacterium bulgaricus K-3 и дрожжей Saccharomyces lactis 19 с высокой антагонистической активностью по отношению к дрожжам рода Candida – возбудителям кандидомикозов и плесневым грибам, изолированным из кишечного тракта человека при дисбактериозах

(51) 12 1/20 (2006.01) 23 9/12 (2006.01) 12 1/225 (2006.01) 12 1/46 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано как для приготовления кисломолочного диетического напитка используемого при медикаментозном лечении микозов, так и для получения столовых кисломолочных продуктов профилактического назначения, а также пробиотика, способствующего элиминации дрожжей рода кандида и плесневых грибов из желудочно-кишечного тракта человека и животных. Поставленная цель достигается применением консорциума молочнокислых бактерий-,-2,-3 и дрожжей 19 симбиотическими взаимоотношениями микроорганизмов,что обусловливает его популяционную устойчивость характеризующегося высокой антагонистической активностью по отношению к дрожжам рода- возбудителям кандидомикозов, а также плесневым грибами, развивающимся в кишечном тракте человека при дисбактериозах.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Саубенова Маргарита Габбасовна Олейникова Елена Андреевна Кузнецова Татьяна Валерьевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ПОПУЛЯЦИОННОУСТОЙЧИВЫЙ КОНСОРЦИУМ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ-1,-2,-3 И ДРОЖЖЕЙ 19 С ВЫСОКОЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ДРОЖЖАМ РОДА ВОЗБУДИТЕЛЯМ КАНДИДОМИКОЗОВ И ПЛЕСНЕВЫМ ГРИБАМ, ИЗОЛИРОВАННЫМ ИЗ КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДИСБАКТЕРИОЗАХ Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано как для получения столовых кисломолочных продуктов профилактического назначения, так и для приготовления кисломолочного диетического напитка, используемого при медикаментозном лечении микозов,а также пробиотика,способствующих элиминации дрожжей рода кандида и плесневых грибов из желудочнокишечного тракта человека и животных. Получен консорциум молочнокислых бактерий,состоящий из-,-2,-3 и лактозосбраживающих дрожжей 19,характеризующийся высокой антагонистической активностью по отношению к дрожжам рода возбудителям кандидомикозов и плесневым грибами, развивающимся в кишечном тракте человека при дисбактериозах. Кроме того он обладает антибактериальной активностью. Консорциум молочнокислых бактерий и дрожжей может быть использован в качестве закваски при получении кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения, а также для производства пробиотика,которые будут использованы для элиминации патогенных дрожжей и плесневых грибов из желудочно-кишечного тракта человека и животных и нормализации его микрофлоры. Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству стабильных заквасок для получения кисломолочных продуктов, а также пробиотиков. Известен консорциум молочнокислых бактерий-104, -2), обладающий более высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенной и патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека(. , , . 209-Р, . , а также Вас. ,) по сравнению с монокультурами этих бактерий (Предвар. патент РК 8945, 2000). Однако консорциум не обладает антагонистической активностью по отношению к грибам, как известно,развивающимся в желудочно-кишечном тракте при дисбактериозах и являющимся потенциальными возбудителями микозов различной локализации. Диаметр зон подавления роста бактериальных тесткультур невелик. Консорциум составлен путем простого смешивания отдельных штаммов молочнокислых бактерий,что не может гарантировать его стабильности при практическом использовании. Известен консорциум микроорганизмов-,АКБ-1,ББ -1,-1 для производства кумыса и шубата(Патент РК 25304, опубл. 20.12.2011, бюл. 12),обладающий способностью подавлять возбудителей кишечных заболеваний (, , . , . 2). Однако он предназначен только для сбраживания кобыльего и верблюжьего молока и противогрибковой активностью он не обладает. Известен консорциум микроорганизмов-,АКБ-1,ББ-1 идля производства кумыса и шубата,обладающий антагонистической активностью, т.е. способностью подавлять возбудителей кишечных заболеваний (, , . , . ),устойчивый к антибиотикам, фагам, содержащий аминокислоты, витамины (Патент РК 25304,2010). Он также не способен ингибировать рост дрожжей рода кандида и плесневых грибов. К тому же для его выращивания требуется кобылье или верблюжье молоко. Известен способ применения молочнокислых бактерий ..для придания противогрибковых свойств ферментированному молочнокислому продукту. Способ предотвращает развитие плесени класса аскомицетов (заявка на изобретение 201012722276/10 Компани Жерве Данонот 10.01.2012). Однако использование этих бактерий способствует подавлению развития только плесени рода . Известен консорциум молочнокислых бактерий и дрожжей (П-1,-3,-5,13), обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным грибам - возбудителям дерматомикозов,дрожжевым грибам, а также к условно-патогенным бактериям (Предвар. патент РК 37179,05.02.2002). Консорциум обладает популяционной устойчивостью лишь при соблюдении оптимальных для него условий культивирования,поэтому хранить его рекомендуется в виде монокультур, а консорциум составлять непосредственно перед использованием. К тому же антагонистическая активность по отношению к дрожжам- основного возбудителя кандидомикозов, а также к плесневым грибам, размножающимся в кишечнике человека при дисбактериозах, у данного консорциума выражена слабо. Сущность изобретения заключается в получении популяционно устойчивого консорциума молочнокислых микроорганизмов с высокой активностью подавления роста дрожжейкак основных и наиболее опасных возбудителей кандидомикозов различной локализации,а также плесневых грибов,развивающихся в кишечном тракте при дисбактериозах. Популяционная устойчивость консорциума достигается путем развития между составляющими его монокультурами микроорганизмов симбиотических взаимоотношений подобно тем, которые имеют место у микроорганизмов, составляющих кефирные зерна. Консорциум составлен путем подбора вновь выделенных штаммов молочнокислых бактерий,которые, в отличие от подавляющего большинства используемых в молочной промышленности молочнокислых бактерий, не стимулируют рост дрожжей рода кандида. Он состоит из молочнокислых бактерий-,-2,-3, а также дрожжей 19, адаптированных друг к другу на уровне метаболитов в условиях полунепрерывного культивирования и находящихся вследствие этого в симбиотических взаимоотношениях,что обеспечивает его популяционную устойчивость и облегчает процесс наработки закваски. Штамм-1 выделен из шубата производства крестьянского хозяйства Агромеркур (г. Есик Алматинской области) и имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки неподвижные клетки овальной или сферической формы, размером от 0,5 до 1,5 мкм, располагаются попарно. Грамположительный. Факультативный анаэроб. Развивается при температуре от 10 С до 40 С,температурный оптимум 30 С. Молоко свертывает с образованием плотного сгустка с кисловатым приятным запахом. На агаризованном гидролизованном молоке образует мелкие(0,4-1,2 мм) каплевидной формы колонии с ровным краем. На среде с мелом образует зоны просветления. При глубинном культивировании колонии имеют форму лодочки или зерна чечевицы. Растет в широком диапазонесреды от 3,0 до 8,8,при высокой концентрации в среде этилового спирта (до 20), а также способен к росту при 4 в среде. Штамм является активным кислотообразователем. Молоко свертывает за 4-7 часов, при этом достигается предельная кислотность 120 Т. Сбраживает галактозу, глюкозу,мальтозу и лактозу. Не сбраживает арабинозу,ксилозу, сахарозу, трегалозу, салицин, инулин,глицерол и сорбитол. Окончательное значениесреды в жидких средах с глюкозой составляет 4,0-4,5. Штамм-2 выделен из творога домашнего производства (г. Талгар Алматинской области) и имеет следующие культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки представляет собой неподвижные округлые или эллипсовидные клетки диаметром 0,7-0,9 мкм, образующие длинные цепочки. Окраска по Граму положительная, спор и капсул не образуют. Факультативный анаэроб,хорошо растет на обезжиренном и гидролизованном молоке, а также на плотных средах, содержащих компоненты молока и ростовые факторы. При поверхностном росте на плотных питательных средах образует мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой и локонообразными краями,при глубинном росте колонии имеют чечевицеобразную форму с боковыми выростами. Способен к росту в широком диапазоне температур - от 20 до 50 С. Оптимальная температура 37-40 С. Молоко сквашивает через 3,5-5,0 часов, предельная кислотность составляет 110-115 Т. Сквашивание молока происходит быстрее при добавлении к нему сахарозы (3). Штамм сбраживает лактозу, глюкозу, сахарозу не сбраживает манит, инулин, глицерин, сорбит,салицин, трегалозу, декстрин и раффинозу. Каталазу не образует. Образует диацетил и ацетоин. При наличии в среде 0,1 метиленового голубого не развивается, при 4 не образует кислоты. Штамм обладает термоустойчивостью. Выдерживает температуру 75 в течение 15 мин и 65 С в течение 30 мин. Штамм-3 выделен из айрана домашнего производства (Алматинская область). Он имеет следующие культуральноморфологические и физиолого-биохимические признаки неподвижные клетки палочковидной формы с закругленными концами 0,5-0,8 мкм в ширину и 4,0-10 мкм в длину, одиночные или в коротких цепочках, реже образуют длинные нити (в зависимости от фазы роста исреды). Спор и капсул не образуют. Окраска по Граму положительная. Первоначальное значениесреды,необходимое для роста и ферментации углеводов,4,5-5,5. Факультативный анаэроб. На обычных средах не растет. При выращивании на молоке вызывает образование однородного плотного сгустка с приятным запахом и вкусом. Температурный оптимум - 37 С, способен к сбраживанию углеводов при температуре до 45 С. Штамм 19 выделен из цельного молока (г. Есик Алматинской области) и имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки клетки овальной формы, имеют длину 4,3-6,3 мкм и ширину 2,9-4,6 мкм. Образует споры, размножается почкованием. Оптимальная температура роста 30 С, максимальная - 50 С, минимальная 15 С. На поверхности сусло-агара образует крупные,блестящие колонии белого цвета, в жидкой среде оседает. Хорошо растет в широком диапазонесреды 3-9, развивается при 4 в среде и выдерживает высокие концентрации сахарозы(до 55). Разжижает желатин, растут на этиловом спирте. Способен образовывать до 1 об. спирта. Сбраживает глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу,слабо раффинозу не сбраживает ксилозу, не усваивает мальтозу, арабинозу, декстрины. Более энергично сбраживает лактозу в присутствии 1,5 молочной кислоты в среде, чем при меньшем ее количестве. Усваивает органические кислоты уксусную, молочную, янтарную, яблочную не усваивает винную, лимонную. Получение консорциума консорциум может быть составлен из суспензии клеток-2,-3,также дрожжей 19, отобранных по принципу отсутствия у них способности стимулировать рост дрожжей рода кандида. Молочнокислые бактерии выращивают на стерильном обезжиренном коровьем молоке, а лактозосбраживающие дрожжи - на молочной сыворотке. Обезжиренное коровье молоко разливают по 100 мл в колбы на 500 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Засевают по 2 мл суспензии каждой культуры, закрывают ватными 3 пробками и помещают на 16-17 часов в термостат при 30 С до получения сгустка с кислотностью 80-90 Т. Проводят полунепрерывное культивирование, заключающееся в ежедневном пересеве с постоянным микробиологическом контролем до получения постоянного процентного соотношения микроорганизмов, то есть устойчивого консорциума. При соблюдении условий культивирования (30 С) соотношение клеток культур молочнокислых бактерий-,-2,-3 и дрожжей 19 уже через 10 суток устанавливается и сохраняется в дальнейшем на уровне 25253515. Более высокое содержание-3 можно объяснить более высокой кислотоустойчивостью этого штамма. Удачный подбор микроорганизмов способствует тому, что между ними складываются симбиотические взаимоотношения, подобные тем,которые имеют место в кефирных зернах. Это обеспечивает популяционную устойчивость консорциума и позволяет при наработке закваски опустить стадию выращивания отдельных микроорганизмов с последующим объединением их в консорциум. Более того, если противогрибковая активность у монокультур молочнокислых бактерий и лактозосбраживающих дрожжей .19 была незначительной или вообще отсутствовала, то полученный консорциум проявил высокую степень ингибирования дрожжейи, а также плесневых грибови. Условия хранения консорциума консорциум сохраняют при 4-5 С на стерильном обезжиренном коровьем молоке после его сбраживания. Пересевы производят через каждые 20 суток, при этом сохраняется первоначальное соотношение микроорганизмов и высокие показатели их биохимической и антагонистической активности. Штаммы, входящие в состав консорциума-1 и-2, поддерживают на косяках с агаризованным гидролизованным молоком и пересевают через три недели, штамм-3 хранят на обезжиренном коровьем молоке после его сбраживания и пересевают через три недели. Дрожжи 19 хранят на агаризованном сусле или молочной сыворотке и пересевают через 30 суток. Температура хранения 4-5 С. Оптимальные свойства консорциума молочнокислых бактерий и дрожжей воспроизводят при соблюдении тех же условий культивирования,при которых он был отселекционирован. Пример 1. Односуточный консорциум молочнокислых бактерий и дрожжей, состоящий из-,-2,-3 и 19, испытывали на антагонистическую активность по отношению к дрожжам рода кандида возбудителям кандидомикозов различной локализации и плесневым грибам, изолированным при дисбиозах кишечника (ТОО Нутритест). Активность проверяли диффузным методом на 4 среде Сабуро при 30 С в сравнении с теми же показателями у монокультур, входящих в них микроорганизмов. Полученные данные приведены в таблице 1. Из данных таблицы 1 можно видеть, что монокультуры молочнокислых бактерий и дрожжей практически не обладают антагонистической активностью в отношении дрожжей рода кандида и плесневых грибов (исключение составляет штамм.-2, проявляющий небольшую активность в отношении дрожжей рода кандида). Напротив, консорциум, составленный из них,проявляет высокую степень ингибирующей их рост активности. Диаметр зон подавления роста дрожжей - возбудителей кандидомикозов составляет 30-32 мм, Диаметр зон подавления роста плесневых грибов- 35 мм,- 20 мм. Пример 2. Поскольку в состав консорциума молочнокислых микроорганизмов входят два штамма бактерий (-2 и-3), представляющих собой термофильные микроорганизмы,его противогрибковую активность испытывали также при 37 С. Противогрибковую активность односуточного консорциума, выращенного на коровьем молоке, проверяли диффузным методом на среде Сабуро. В таблице 2 приведены результаты исследований антагонистической активности консорциума в отношении дрожжей рода кандида и плесневых грибов, изолированных при дисбиозах кишечника, по сравнению с монокультурами входящих в него молочнокислых бактерий и дрожжей. Полученные данные показали, что противогрибковая активность консорциума в этих условиях резко снижается. Причиной это то,по-видимому, может быть как повышенный синтез противогрибковых метаболитов при 30 С, так и,возможно, частичная инактивация этих соединений при повышенной температуре. Пример 3. Полученный консорциум молочнокислых бактерий и лактозосбраживающих дрожжей подавляет жизнедеятельность в кишечном тракте человека патогенных и условно-патогенных грибов. Применение для подавления их роста медикаментозных химических препаратов обычно чревато тем, что при этом получают селективные преимущества бактериальные организмы. Среди них могут быть патогенные и условно-патогенные бактерии. Для сохранения здоровья человека необходима нормализация микрофлоры его желудочно-кишечного тракта. Поэтому используемый в качестве диетического и лечебнопрофилактического средства молочнокислый продукт, в отличие от химических препаратов, не должен сдвигать равновесия в составе микрофлоры кишечника, а, напротив, должен способствовать его нормализации. Поэтому необходимо было выявить,как полученный консорциум микроорганизмов влияет на широкий набор бактерий, способных вызывать те или иные заболевания. В таблице 3 приведены данные по исследованию влияния консорциума на рост возбудителей различных заболеваний человека. Можно видеть, что консорциум обладает достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к исследуемым тест-культурам условно-патогенных бактерий, что обеспечивает его нормализующее воздействие на микрофлору желудочно-кишечного тракта человека. На антибактериальную активность консорциума большое влияние оказывает температура культивирования, наиболее выражена она при 30 С. Таблица 1. Антагонистическая активность консорциума и монокультур молочнокислых микроорганизмов по отношению к дрожжам рода кандида и плесневым грибам при 30 С Тесткультуры Средний диаметр зоны подавления роста тест-культуры, мм Таблица 2. Антагонистическая активность консорциума и монокультур молочнокислых микроорганизмов по отношению к дрожжам рода кандида и плесневым грибам при 37 С Тесткультуры Средний диаметр зоны подавления роста тест-культуры, мм Таблица 3. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий по отношению к условно-патогенным бактериям Бактериальные тест-культуры Зоны подавления роста тест-культуры, мм 18/17. 10/0.19/16 1 вакцина Ценковского 9/0 Примечание первый показатель размера зоны подавления роста тест-культуры - после культивирования микроорганизмов при 30 С, второй - при 40 С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Популяционноустойчивый консорциум молочнокислых бактерий-,-2,-3 и дрожжей 19,депонированных в коллекции РГП на ПХВ Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК, используемый в качестве закваски для получения как столовых, так и диетических молочнокислых напитков и пробиотиков лечебно-профилактического назначения, ингибирующий рост дрожжей родаи плесневых грибов - возбудителей микозов.