Штамм микроорганизмов Bacillus megaterium F-1 для производства фосфатмобилизующего землеудобрительного препарата

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/11 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ адаптационными возможностями, способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Штамм-4 выделен из ризосферы картофеля Северного Казахстана,обладающий способностью поддерживать определенную концентрацию фосфатов в растворе,обеспечивая тем самым их дальнейшее поглощение растениями. Высокая продуктивность заявляемого штамма,способность образовывать биомассу в широком диапазоне температур (27-32 С) и(6,0-8,0), а также дешевая среда культивирования позволяют рекомендовать штамм-4 к использованию в производстве для получения перспективного биоудобрения. При соблюдении условий ферментации 72 часа культивирования и распылительной сушки культуральной жидкости,титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Коха, составляет не менее 5,3109 КОЕ/г.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Сураганова Динара Аскаровна Есенбаева Акмарал Ертугановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан-1 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩЕГО ЗЕМЛЕУДОБРИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения удобрения на основе микроорганизмов, обладающих свойством мобилизовать фосфор. Целью изобретения является получение активного штамма,обладающего высокими Изобретение относится к сельскому хозяйству,касается нового штамма, используемого для производства биологического удобрения. Выделение фосфатмобилизующих микроорганизмов проводили из ризосферы картофеля Северного Казахстана. Штамм-1 обладает способностью поддерживать определенную концентрацию фосфатов в растворе, обеспечивая тем самым их дальнейшее поглощение растениями. Такой тип культур является перспективным для создания биофосфорного удобрения. Фосфор находится в почве в составе химических соединений,усвоение которых недоступно растениям. Такого неподвижного, необменного фосфора в почве содержится очень много, до 5-6 тонн в каждом гектаре. Фосфатмобилизирующие бактерии живут в почве, разлагают органические вещества и высвобождают содержащийся в них фосфор, переводя его в растворимые соли фосфорной кислоты. Образуемые в дальнейшем соединения фосфорной кислоты становятся доступны для усвоения растениями. Наиболее выгодным и экологически безопасным приемом повышения подвижности фосфора в почве и его доступности растениям является микробиологическая фосфатмобилизацияприменение бактериальных препаратов,усиливающих мобилизацию фосфора из труднодоступных соединений почвы в легкодоступные. Использование живых микроорганизмов позволяет сократить геологический круговорот за счет их способности переводить метаболически неактивные, связанные химические элементы в доступные для растений формы. В результате происходит высвобождение из труднодоступных фосфатов от 10 до 40 подвижных и доступных растениям соединений фосфора,,,.. 19,1-62010. , . 2010.65-68. Известны штаммы.Вагу (200-208), обладающие свойством мобилизовать фосфор. Штаммы - аналоги находятся на хранении в ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов). Данные об этих штаммах получены из Каталога штаммов Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов,1997 г Использование данного штамма для получения биологического удобрения затруднено в связи с низкой устойчивостью данных микроорганизмов к факторам окружающей среды В-847 , 847 , 49..1950. . ( 9, 30 , -1,-4). Наиболее близким к полученному является штаммВагу 1884,обладающий свойством мобилизовать фосфор. Недостатками известного штамма являются его 2 ограниченная функциональная способность выщелачивать фосфор и большая подверженность лизису колоний на скошенной агаризованной среде Патент РФ 2081867. Штамм бактерийдля получения удобрения и экзополимера, дата публикации 20.06.1997. Известен штамм 4 ГОСТ 26211-91 Почвы. Определение подвижных соединений фосфора по методу Аррениуса в модификации ВИУА утв. Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 29 декабря 1991 года 2389, обладающий фосфатмобилизующей активностью из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Недостатком этого штамма является очень невысокая продуктивность и нестабильная фосфатмобилизующая активность при выращивании на промышленной питательной среде следующего состава, меласса - 0,6 К 2 НР 4 - 0,03 472 0,1- 0,05 3- 0,1 мел - 0,1. Задачей изобретения является получение активного штамма-1,обладающего свойством мобилизовать фосфор,способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава,обладающего высокими адаптационными свойствами. Культурально-морфологические признаки Родословная штамма группа грамположительных палочек и кокков, образующих эндоспоры Родвид. Клетки прямые палочковидные клетки с закругленными концами, размером 1,9-0,5 мкм,расположенные одиночно попарно или в виде цепочки. Спорообразование образуют сферические эндоспоры. Тип деления простой. Подвижность клетки подвижные. Пигментация колоний/ биомассы. Через 18 ч роста на мясопептонном агаре (МПА) или картофельноглюкозном агаре клетки образуют колонии грязнобелого цвета. Не выделяют пигменты в питательную среду. При культивировании штамма на МПА,картофельном агаре, сусло-агаре в течении 24 ч при(281 С) образуются складчатые колонии, вязкой консистенции, телесного цвета. Физиолого-биохимические признаки Не растет в анаэробных условиях, оптимальная температура роста (28)-(31)С,6,8-7,2. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу,ксилозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину,утилизирует цитрат. Каталазоположительный. При хранении чистой культуры на скошенном агаре в холодильнике при температуре 4 С консистенция и окрашивание штриха не изменяются в течение 4-6 месяцев. Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным, не обладает гемолитической и лецитиназной активностью, не представляет опасности по другим причинам (Заключение ТОО Нутритест 2-16/1178 от 1 августа 2013 г). Штамм -1 идентифицировали по Определителю Берджи (1974) как вид. Штамм-1 депонирован и хранится в коллекции культур РГП Республиканская коллекция микроорганизмов Центральный музей микроорганизмов под регистрационным номером(свидетельство о депонировании от 09.08.13 г.). Микроорганизмы-0513 хорошо растут на питательных средах следующего состава Питательная среда для. Состав (г/л)(4)24 - 0,5 47 Н 2 - 0,3- 0,3- 0,3 472 - 0,001 4 52 - 0,001 3 - 5,0 глюкоза - 10,0 экстракт кормовых дрожжей - 2,0 вода водопроводная - до 1 лсреды - 7,1. Пептонная среда. Состав (г/л) пептон - 10,0 4720 - 0,5- 3,0 глюкоза - 5,0 вода водопроводная - до 1 лсреды 7,2-7,4. Среда М-1. Состав (г/л) (4)24 - 0,5 472 - 0,3- 0,3 СаСО - 3,0 К 2 НРО 432 О - 0,5 24 - 0,5 меласса - 20,0 кукурузный экстракт - 1,0 среды 6,8-7,2. Картофельный агар. Состав (г/л) глюкоза - 10,0 агар - 15,0 отвар из 600 г картофеля - до 1 л,среды 6,8-7,0. Культураобразует колонии на картофельном агаре и питательной среде М-1 агаризованной. После культивирования при 28(1)С в течение 50 ч на картофельном агаре образовывались выпуклые слизистые колонии с неровным краем. Через 72 ч на среде М-1 также образовывались выпуклые колонии с неровным краем. Для поддержания культуры в лабораторных условиях использовали агаризованную питательную среду - картофельный агар. Глубинное культивирование отрабатывали в лабораторных условиях в качалочных колбах Эрленмейра объемом 750 мл. Культивирование осуществляли в течение 72 часов при температуре 28(1)С, режиме воздухообмена 220 об/мин. После окончания процесса культивирования проводили высев на плотные питательные среды для- на картофельный агар и питательную среду(для подтверждения сохранения фосфатмобилизирующей активности). Для глубинного культивирования в условиях масштабирования использовали пептонную среду и питательную среду с мелассой М-1. Соблюдали одинаковые условия культивирования температура 28(1)С,воздухообмен 330 об/мин. Титр микроорганизмов при культивировании на пептонной среде составил 6,5108 КОЕ/мл, при культивировании на питательной среде с мелассой - 3,1108 КОЕ/мл. Оптимальными условиями для культивирования являются температура 30 (1)С, частота оборотов мешалки 400 об/мин,время культивирования для- 72 часа. Пример 1. Получение бактериального удобрения на основе микроорганизмов. Штаммвыращивали на скошенном картофельном агаре в течение 72 часов при температуре 28(1)С. Биомассу смывали с косяка 10 мл стерильного физиологического раствора, по 5 мл суспензии использовали для засева качалочных колб, содержащих жидкую пептонную среду. Наработку посевного материала осуществляли в инкубаторе-шейкере при 220 об/мин, 28 С в течение 72 часов. Титр посевного материала после инкубации составлял не менее 9,110 КОЕ/мл. 400 мл бактериальной суспензии использовали для засева ферментера объемом 10 л при температуре 28(1)С,6,8-7,2, давлении 0,02-0,04 Мпа. Титр микроорганизмовпосле 72 часов культивирования,определяемый по Коху - 6,510 КОЕ/мл. Культуральную жидкость высушивали на распылительной установке при температуре 110 С на входе и 72 С на выходе, в качестве наполнителя использовали 1 натрия хлорида,титр микроорганизмов составил - 5,3109 КОЕ/г. Полученный сухой порошок можно использовать для создания перспективного биофосфорного удобрения. Пример 2. Определение фосфатмобилизирующей активности. Для определения фосфатмобилизирующей активности использовали следующие питательные среды Среда Герретсена в модификации Муромцева. Состав среды, г/л глюкоза - 10,0 аспарагин - 1,0 сульфат калия - 0,2 сульфат магния - 0,2 кукурузный экстракт - 0,02 водопроводная вода до 1 л. Фосфат кальция вносили в питательную среду методом осаждения в стерильную расплавленную агаризованную среду вносили шестиводный хлорид кальция или хлорид железа , после его растворения добавляли в пропорциональных количествах двенадцативодный фосфат натрия. Среда агаризованная. Состав (г/л) глюкоза - 10,0 трикальцийфосфат - 5,0 26 Н 2 - 5,0 47 Н 20 - 0,25 калия хлорид - 2,0 аммония сульфат - 0,1 агар - 15,0,6,8-7,0. Смыв биомассы микроорганизмов с поверхности питательной среды вносили в качалочные колбы с жидкой средой Герретсена с трикальцийфосфатом и в колбы со средой Герретсена с фосфатом железа. Во время приготовления питательной среды соли кальция и натрия или железа и натрия вносили отдельно в каждую колбу для достижения концентрации 3 мг/мл. Посевы инкубировали на шейкере-инкубаторе при 28 С и 190 об/мин в течение 72 часов. После получения накопительной культуры на жидкой среде Герретсена готовили десятикратные разведения культуральной жидкости до 10 б в стерильном 0,9 хлориде натрия. Оптимальными для определения способности микроорганизмов к растворению фосфатов являются питательные среды , - с 0,025 г/л бромфенолового синего. Количество 3 свободного фосфора определяли спектрофотометрически - по реакции образования фосформолибденовой сини в присутствии гидрохинона 3. Количество свободного фосфора в составе питательной среды составило 2,35(0,05) мг/мл с титром клеток - 8,5108 КОЕ/мл. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм-1, депонирован в коллекции культур РГП Республиканская коллекция микроорганизмов Центральный музей микроорганизмов, под номером 0513,используемый для получения биологического удобрения, на основе фосфатмобилизующего микроорганизма.