Штамм вируса гриппа h1n1 а/атырау/874/12, используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) 12 1/92 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН///3/2009 (11) и на 98 гомологии - с ///1973 (11). При этом казахстанский изолят отличается филогенетически от штаммов, выделенных в Казахстане ранее(2009 г.) в г.Алматы и в г.Астана, которые представляют отдельную линию генетического кластера, но имеют общий корень с вирусами,выделенными в 2001-2003 годах в Нью-Йорке. Изолят обладает гемагглютинирующей (1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 1640), характеризуется термостабильным гемагглютинином, поскольку сохранял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 240 мин.,репродуцируется в системе куриного эмбриона и культуре клеток МДСК при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра на куриных эмбрионах - 3,50 ЭИД 50/0,2 мл, на культуре клеток МДСК - 3,25 БОЕ/мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов РГП НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК за номером депозита -08-14/. Предлагаемый вариант активно агглютинирует эритроциты курицы, морской свинки, барана, лошади, крупного рогатого скота и человека. Штамм вируса гриппа А/Атырау/874/12 (11) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Кливлеева Наиля Галивеевна Шаменова Мира Галаутдиновна Глебова Татьяна Ивановна Баймаханова Байкен Бекарыстановна Кузнецова Татьяна Владимировна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА 11 А/АТЫРАУ/874/12, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических препаратов к вирусу гриппа А подтипа 11,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/Атырау/874/12 с целью приготовления на его основе диагностических тестсистем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. По генам НА иштамм вируса гриппа А/Атырау/874/12 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для научных целей и получения специфических тест-систем для диагностики гриппозной инфекции. Вирусы гриппа принадлежат к семейству. включающему 5 родов вирусы гриппа А, В, С,и . К настоящему времени известны 16 разновидностей гемагглютинина (НА) и 9 нейраминидазы , на основе которых классифицируются различные антигенные подтипы вируса гриппа, .О.Т..//. .- 1992.- . 56 152-179.,,.,..( 6)// .- 2005.- . 79, 5.- . 28142822 Вирусы гриппа А изолированы от широкого круга хозяев, включая более 100 видов птиц, из млекопитающих к нему восприимчивы человек и домашние животные (свиньи, лошади, кошки), а также грызуны,норки,тигры,тюлени,китообразные //. . . . .. 1987. .2. . 15-37 Известен референсный вариант вируса гриппа/ /18/76 (11), циркулировал среди новобранцев в Форт-Диксе (шт. Нью Джерси,США), но не проявивший эпидемической активности,//. 1979. . 11. . 9 В марте 1982 г. от двух заболевших подростков в сельской местности Болгарии, имевших контакт как между собой, так и с животными на приусадебных участках, были выделены вирусы гриппа А с НАЛьвов Д.К., Николаева В., Коцева Р. И. Информация о штаммах, родственных А/Нью Джерси/8/76, изолированных от людей в 1982 г. // Регионный центр по гриппу заквартал 1982 г. Обзор. М. 1982. .21-23.). В 1986 г. в Китае наблюдалась эпидемия гриппа/11 Киселев О.И. Пути эволюции вирусов гриппа типа А роль белка -1 в патогенности //Грипп и грипиоподобные инфекции, включая особооспасные формы гриппозной инфекции. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения. Бюллетень проблемной комиссии. Санкт-Петербург. 2008. с.49-63 Вирусы- привели к сезонному подъему заболеваемости гриппом людей в Алма-Ате (Казахстан) в 1984 г. Чувакова З.К.,Ровнова З.И., Исаева Е.И. и др. Три случая изоляции вируса гриппа А с гемагглютиииномот людей в 1983 г. в Алма-Ате // Вопр. Вирусол. 5. 1985. с.530-536 В 1988 г. в США выявлен вирус свиного гриппа 11 у ранее здоровой беременной женщины, которая вскоре умерла Свиной грипп. Обзор //Ветеринария.5(9). 2009, Икранбегийн Р. Обзор информации по молекулярной эпидемиологии вируса гриппа свиней 11//Вестник НАН РК. 2004. 4. с.152-159 Имеются сведения о спорадических случаях выделения классического вируса гриппа свиней от больных людей, не имевших контакт со свиньями в Швейцарии и Нидерландах. С,М.Н 2.139.4. . 429-437 В марте 2009 г. около г. Мехико возникла эпизоотия гриппа свиней, от которых был выделен вирус гриппа /11. Этот вирус оказался способным инфицировать людей и передаваться от зараженных лиц контактным людям и распространился в США, Канаду, а затем и в другие страны всех континентов. В России эпидемия захватила 49 городов и закончилась в конце января 2010 г. Карпова Л.С. Маринич И.Г., Поповпева Н.М Столярова Т.П. Эпидемиология гриппа(11) Калифорния/07/09 среди населения 49 городов России в сезон 2009-2010 гг. //Журн. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 3. 2011. с.14-20 В это же время на территории Казахстана от больных людей были выделены свиные вирусы гриппа /11 Икранбегийн Р., Кузнецова Т.В Грудинин М.П. и др. молекулярно-генетические свойства пандемического вируса,циркулировавшего на территории Казахстана (20092010) //Вестник НГУ. Т. 10(3). 2012. с.80-86 Молекулярно-генетический анализ последовательностей НА ипоказал, что идентичность выделенных изолятов со штаммом А/Калифорния/04/09 составила 99,2-99,4. В 2012 г. из биологических проб, собранных в поликлиниках и инфекционных больницах г.Атырау, выделен штамм вируса гриппа /11. Изоляция вируса гриппа А/Атырау/874/12 (11),по антигенной характеристике родственного с эталоном А/Соломоновы Острова/03/06 (11) и///1973 (11), свидетельствует о потенциальной возможности циркуляции в РК эпидемически значимого варианта вируса гриппа 13. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/Атырау/874/12 (11),позволяющего использовать его в качестве диагностикума с целью выявления специфических антител в сыворотках крови больных людей современным вариантом вируса гриппа А подтипа Н 1, а также для проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Технический результат обеспечивается изоляцией оригинального казахстанского варианта вируса гриппа(11) отличного от эталонных и ранее выделенных штаммов, и обладающим уникальными антигенными и биологическими характеристиками. Новый штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов РГП НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК (депозит-08-14/). Антигенная структура. Выделенный штамм идентифицировали в реакциях торможения гемагглютинации(РИНА) с использованием набора диагностических сывороток к вирусам гриппа (табл. 1, 2). Результаты,представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что штамм А/Атырау/874/12 имеет антигенную формулу 11. Генетическая характеристика вируса А/Атырау/874/12 (11) дана с помощью секвенирования нуклеотидной последовательности гена НА и(Рисунок). Результаты сравнительного анализа 1701 нуклеотидов гена НА и 1413 нуклеотидов гена вируса А/Атырау/874/12 (11) с штаммами из ,представленные на рисунке, показывают, что вирус гриппа А/Атырау/874/12 по генам НА ипроявляет 99 идентичности с///3/2009 (11) и на 98 гомологии - с ///1973 (11). При этом казахстанский изолят отличается филогенетически от штаммов, выделенных в Казахстане ранее(2009 г.) в г. Алматы и в г.Астана, которые представляют отдельную линию генетического кластера, но имеют общий корень с вирусами,выделенными в 2001-2003 годах в Нью-Йорке. Адаптационные свойства. А/Атырау/874/12(11) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона и культуре клеток МДСК при оптимальной (37 С) температуре. На куриных эмбрионах инфекционный титр составил 3,50 ЭИД 50/0,2 мл, титр гемагглютинации - 1128. На культуре клеток МДСК эти показатели составили 3,25 БОЕ/мл и 132. Штамм характеризуется высокой антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 1640). Свойства агглютинации. Исследуемый штамм активно агглютинирует эритроциты курицы,морской свинки, барана, лошади, крупного рогатого скота и человека. Терморезистентность. Предлагаемый штамм обладает термостабильным НА, поскольку сохранял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 240 мин. Ингибиторочувствителъностъ. Штамм А/Атырау/874/12 (11) оказался резистентным к неспецифическим ингибиторам нативных и прогретых (62 С - 30 мин, 100 С - 10 мин) сывороток морской свинки и кролика. Элюирующая активность. По скорости элюции с нативных куриных эритроцитов исследуемый штамм относится к быстроэлюирующему варианту,так как полностью элюировал через 30 мин инкубации при 37 С. К выделенному штамму А/Атырау/874/12(11) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы шиншила массой 2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адъювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 1640. Молекулярно-биологические свойства указывают на то, что вирус А/Атырау/874/12 (11) отличается от эталонного штамма вируса гриппа А подтипа 11 и является новым природным,эпидемическим вариантом вируса гриппа(11). Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических вспышек гриппа. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/Атырау/874/12 Иммунная сыворотка к референсному Гомологичный Титр антител к изоляту штамму титр А/Атырау/874/12 А/Киев/3304/84 (11) 640 160 А/Иоханесбург/82/96 (11) 320 80 А/Соломоновы Острова/03/06 (11) 640 640 А/Новая Каледония/20/99 (11) 640 160 А///1973 (11) (11) 640 640 Примечания 1 даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов 2 с иммунными сыворотками к вирусу гриппа с подтипом гемагглютинина Н 3 и к вирусу гриппа типа В получены отрицательные результаты. Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/Атырау/874/12 Тигр антител к подтипу нейраминидазы Изолят А/Атырау/874/12 1 100 2 20 Примечание - даны обратные величины титров специфических антител. используемый для приготовления диагностических препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа 11 А/Атырау/874/12,депонирован в коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК под номером -08-14/, Верстка Н.Киселева Корректор К.Сакалова 4