Штамм вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (H16N3), используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2010.01) 12 1/92 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ чайка/Атырау/2216/07 с целью приготовления на его основе диагностических тест-систем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. Штамм вируса гриппа А/Серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163) по структуре гемагглютинина близок к вирусу А/озерная чайка/Монголия/1756/2006 (98), обладает высокой гемагглютинирующей(1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280),характеризуется термолабильным гемагглютинином, поскольку терял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 15 мин.,репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,0 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии МОН РК за номером депозита М 5-09/Д. Предлагаемый вариант активно агглютинирует эритроциты курицы, морской свинки, мыши, кошки, лошади, козы, барана,крупного рогатого скота. Штамм вируса гриппа А/Серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А птиц и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич Ишмухаметова Наиля Галивеевна Жуматов Кайнар Хамзаевич Асанова Сауле Естаевна Карамендин Кобей Омертаевич Даулбаева Клара Дакишевна Саятов Марат Хусаинович(73) Дочернее государственное предприятие Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Ямникова С.С., Гамбарян А.С., Аристова В.А.,Львов Д.К., Ломакина Н.Ф.,.,., Вирусы гриппа А/Н 13 и А/16 различные линии одного предшественника // Вопросы вирусологии. 2009. 4. С.10-18(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ А/СЕРЕБРИСТАЯ ЧАЙКА/АТЫРАУ/2216/07(163),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических препаратов к вирусу гриппа А подтипа 163,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/Серебристая Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения специфических тест-систем для диагностики гриппозной инфекции диких и домашних птиц, а также проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. Вирусы гриппа принадлежат к семейству, включающему 5 родов вирусы гриппа А, В, С,и . На основе их антигенных различий по двум поверхностным гликопротеидам - гемагглютинину (НА) и нейраминидазе , вирусы гриппа А разделяются на различные подтипы ,., 2004. К настоящему времени известны 16 подтипов НА ( - 6) и 9 подтипов(1 - 9). Экологические и филогенетические исследования показали, что птицы водного и околоводного комплексов играют основную роль в процессе эволюции и сохранения вирусов гриппа в биосфере. От них изолированы все известные для науки сероварианты вирусов гриппа А, вызвавшие пандемии и эпизоотииС, 1997 Львов Д.К и др., 2004. В 1999 г. от озерных чаек в Швеции выделены изоляты вируса гриппа А с ранее неизвестным подтипом НА. В реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции двойной иммунодиффузии они не взаимодействовали с сыворотками к НА подтипов Н 1-Н 15 и были отнесены к вирусам с новым подтипом НА -6. Изолят А/озерная чайка/Швеция/99 служит эталоном при изучении вновь выделяемых штаммов. Выявлена отдаленная генетическая связь НА 6 с НА подтипа Н 13, который также обнаруживается в основном в структуре вирусов, циркулирующих у чайковых птиц..., 2005. Известен изолят А/озерная чайка/Монголия/1756/2006, отнесенный к подтипу 163. . ., 2009. Известны также изоляты А/морской голубок/Астрахань/28/76 и А/озерная чайка/Туркменистан/13/76 идентифицированные как вирус гриппа 163 лишь в 2009 г. С. С. Ямникова и др.,2009. Задачей изобретения является получение нового,оригинального казахстанского штамма вируса гриппа А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163), позволяющего использовать его в качестве диагностикума для выявления специфических антител в сыворотках крови птиц инфицированных вирусом данной разновидности, а также для проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. В 2007 г. впервые на территории Казахстана в регионе Каспийского моря из клоакального смыва клинически здоровой птицы выделен вирус гриппа А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 А.И. Кыдырманов и др., 2008, в антигеном отношении близкий к эталону А/озерная чайка/Швеция/5/99(163). С иммунной сывороткой к этому вирусу казахстанский изолят взаимодействовал в РТГА догомологичного титра и не реагировал с(табл. 1). Ферментативная активность изолята А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163) в РИНА подавлялась моноспецифической сывороткой к 3 (табл. 2). С диагностическими сыворотками, содержащими антитела к 1 - 2,4 -9 получены отрицательные результаты. Таким образом, выделенный изолят отнесен к вирусу с антигенной формулой 163. Новый казахстанский вариант вируса гриппа А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) отличается от эталонных и ранее выделенных штаммов, и обладает уникальными антигенными и биологическими характеристиками,что обеспечивает технический результат. Штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии КН МОН РК (депозитМ-8-09/Д). Изолят А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) активно репродуцирует в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,0 ЭИД 50/0,2 мл. Он обладает высокой гемагглютинирующей (1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в реакции торможения гемагглютинации 11280). Допустимая длительность хранения при -20 С-2 года. Антигенная структура. Выделенный изолят изучали в РТГА и РИНА с использованием набора референсных сывороток к вирусам гриппа с подтипами НА Н 1-Н 16 и 1 - 9 (табл. 1, 2). Результаты, представленные в таблицах 1 и 2,показывают,что штамм А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 имеет антигенную формулу 163. Более детальная характеристика этого вируса дана при определении нуклеотидной последовательности гена НА методом секвенирования. Результаты сравнительного анализа, проведенного с помощью программыи метода, 1563 нуклеотидов гена НА штамма А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163) с аналогичными последовательностями четырех различных референсных вирусов подтипа 163 1976-2006 гг. из международной базы данных,представлены в таблице 3. Видно, что в филогенетическом отношении изолят А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 наиболее близок к вирусу А/озерная чайка/Монголия/1756/2006 (98). Свойства агглютинации. Исследуемый вирус активно агглютинирует эритроциты курицы,морской свинки, мыши, кошки, лошади, козы,барана, крупного рогатого скота. Терморезистентностъ. По термочувствительности НА изолят А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) отнесен к термолабильному варианту, поскольку терял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 15 мин. Ингибиторочувствительностъ. Предлагаемый штамм проявляет ингибиторорезистентность к нативным и прогретым сывороткам курицы,морской свинки, крысы, кролика, барана и лошади. Элюирующая активность. Время элюции с нативных куриных эритроцитов вируса А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163) при 37 С составляет 3 ч. К штамму А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) получена кроличья иммунная сыворотка с титром в РТГА 11280. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы Шиншила массой 2,53 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 11280. Изолят А/серебристая чайка/Атырау/2216/07(163) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,0 ЭИД 50/0,2 мл. Он характеризуется высокой гемагглютинирующей(1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в реакции торможения гемагглютинации 11280). Выявленные отличия указывают на то, что вирус А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163) не идентичен ранее известному эталонному варианту вируса гриппа А/озерная чайка/Швеция/5/99 (16 3) и является новым природным, эпизоотическим изолятом вируса гриппа. Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета у диких птиц. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолято вируса гриппа А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 в РТГА Иммунная сыворотка к референсному штамму Примечания даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вмрусам гриппа с подтипами гемагглютинина Н 1-Н 15 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахского изолята вируса гриппа А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 в РИНА Изолят Примечания -- реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности иммунной сывороткой Таблица 3 Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов гена гемагглютинина казахстанского штамма А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 с вирусами гриппа(163) из международной базы данных (в ) А/озерная А/морской А/озерная А/серебристая чайка/Туркмени голубок/Астрахан чайка/Монголия чайка/Атырау/ стан/13/76 ь/28/76 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Атырау/2216/07 (163), депонированный в Коллекции микроорганизмов ДГП Научно исследовательского институт проблем биологической безопасности НЦБ КН МОН РК,под регистрационным номером М-8-09/Д,используемый для приготовления диагностических препаратов