Штамм вируса гриппа птиц подтипа H4N6 А/лысуха/Актау/1454/06, используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ целью приготовления на его основе диагностических препаратов пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. Штамм вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06(46) по структуре гемагглютинина имеет сходство с эталоном А/утка/Чехословакия/1/56(1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280), характеризуется термостабильным гемагглютинином, сохраняющим способность агглютинировать эритроциты курицы после прогревания при 56 С в течение 240-360 мин, репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной(37 С) температуре до инфекционного титра 8,83 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии МОН РК за номером депозита М-8-08/Д. Предлагаемый вариант агглютинирует эритроциты человека 0 группы, курицы, морской свинки, мыши, кошки,козы, барана, лошади, крупного рогатого скота и верблюда Штамм вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06(46) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А птиц и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Саятов Марат Хусаинович Березин Владимир Элеазарович Богоявленский Андрей Павлинович Ишмухаметова Наиля Галивеевна Асанова Сауле Естаевна Даулбаева Клара Дакишевна Шахворостова Лариса Ивановна Коротецкий Илья Сергеевич Зайцева Ирина Алексеевна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т., и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России в 1979-2002 гг. // Вирусология, 2004, 3, с. 17-24(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА 46 А/ЛЫСУХА/АКТАУ/1454/06,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических тест-систем к вирусу гриппа А подтипа 46,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06 с 22597 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения специфических тест-систем для диагностики гриппозной инфекции диких и домашних птиц, а также проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. Вирусы гриппа А,помимо человека,изолированы от широкого круга хозяев и разделяются на основе антигенных свойств поверхностных гликопротеидов-гемагглютинина и нейраминидазы. К настоящему времени идентифицировано 16 подтипов гемагглютинина и 9 подтипов нейраминидазы (,,. 2000.- 1024 .,.,..(6)// .- 2005.- . 79, 5.- . 28142822.). Орнитофауна играет основную роль в процессе эволюции и сохранения вируса гриппа А в биосфере, и является потенциальным источником эпидемически актуальных вариантов. Все подтипы вируса гриппа А выделены от птиц водного и околоводного комплексов, в организме которых они реплицируются в клетках респираторного и кишечного трактов. Вирусы гриппа А с гемагглютинином Н 4 являются наиболее часто изолируемыми возбудителями этого заболевания и характеризуются широким кругом хозяев. Известен штамм А/утка/Чехословакия/56(46), который служит в качестве эталона при серологической диагностике инфекции,обусловленной вирусом гриппа сероварианта/46. При сравнительном иммунологическом анализе с большим набором моноклональных антител среди 25 штаммов вируса гриппа подтипа Н 4 выявлено девять серологически различных групп( .,..4//.- 1982.- . 72 217-221). Известен штамм А/утка/Сибирь/378/01 с такой же антигенной формулой. Штаммы серовариантов 42, 46, 48 и 49 активно циркулировали в природных биоценозах России в 2000-2002 годах. Д. Львовым и др. показана их значительная вариабельность по данным филогенетического анализа штаммы подтипа 46 разделяются на две группы изолированные в южной и западной экосистемах (Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т. и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России в 1979-2002 гг. //Вопр. Вирусол.- 2004.-3.с. 17-24). В 2006 г. на северо-восточном побережье Каспийского моря из клоакального смыва клинически здоровой птицы впервые на территории Казахстана изолирован штамм вируса гриппа 2 А/лысуха/Актау/1454/06 антигенно близкий эталону А/утка/Чехословакия/1/56 (46), с иммунной сывороткой к которому взаимодействовал до 1/32 гомологичного титра (1160). С иммунными сыворотками к вирусам с подтипами гемагглютинина Н 1-Н 3,Н 5-Н 16 получены отрицательные результаты (табл. 1). Нейраминидаза изолята А/лысуха/Актау/1454/06 отнесена к подтипу 6(46) может использоваться для выявления специфических антител в сыворотках крови инфицированных птиц. Новый штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии КН МОН РК (депозит М-8-08/Д) от 11.03.2008. Задачей изобретения является получение нового штамма А/лысуха/Актау/1454/06(46),позволяющего использовать его в качестве диагностикума для выявления специфических антител в сыворотках крови птиц инфицированных вирусом гриппа А подтипа 46. Антигенная структура. Выделенный штамм изучали в реакциях торможения гемагглютинации и подавления нейраминидазной активности с использованием набора референсных сывороток к вирусам гриппа с подтипами гемагглютининов 116 и нейраминидазы 1-9 (табл. 1, 2). Результаты, представленные в таблицах 1 и 2,показывают, что штамм А/лысуха/Актау/1454/06 имеет антигенную формулу 46. Более детальная антигенная характеристика этого вируса дана с помощью определения нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина методом секвенирования. Результаты сравнительного анализа 1700 нуклеотидов гена гемагглютинина,представленные на рисунке,показывают, что штамм А/лысуха/Актау/1454/06 (46) отличается от ранее выделенного штамма А/утка/Сибирь/ 378/01 на 12,5 от вируса А/утка/Чехословакия/56 на 10,0, А/утка/Альберта/28/76 - на 19,8. Адаптационные свойства. Штамм А/лысуха/Актау/1454/06(46) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 8,83 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм характеризуется высокой гемагглютинирующей (1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280). Свойства агглютинации. Исследуемый штамм в среднегеометрических титрах 8,00,0 - 11,70,6 агглютинирует эритроциты человека 0 группы,курицы, морской свинки, мыши, кошки, козы,барана, лошади, крупного рогатого скота и верблюда. Терморезистентность. Предлагаемый штамм обладает термостабильным гемагглютинином,сохраняющим способность вызывать агглютинацию 22597 эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 240-360 мин. Ингибиторочувствительность. Штамм А/лысуха/Актау/1454/06 (46) характеризуется резистентностью к ингибиторам нативных и прогретых сывороток крови, курицы, кролика,лошади и человека, его активность подавлялась прогретыми (620 С, 1000 С) сыворотками крови морской свинки, крысы, барана и крупного рогатого скота. Элюирующая активность. По скорости элюции с нативных куриных эритроцитов исследуемый штамм относится к быстро элюирующему варианту,так как полностью элюировал через 15-20 мин инкубации при 37 С. Патогенность. Штамм А/лысуха/Актау/1454/06(46) отнесен к непатогенному типу с интравенозным индексом патогенности для шестинедельных цыплят равным 0. К выделенному штамму А/лысуха/Актау/1454/06(46) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы шиншила массой 2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 11280. Таким образом,сравнительное изучение казахстанского штамма вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06(46) с другими штаммами этого подтипа - А/утка/Чехословакия/56,А/утка/Сибирь/378/01,А/утка/Альберта/28/76 позволило выявить различия между ними по нуклеотидному составу важнейшего поверхностного антигена-гемагглютинина. Выявленные отличия указывают на то, что вирус А/лысуха/Актау/1454/06 (46) отличается от прототипного эталонного и ранее выделенных штаммов этой разновидности, и представляет собой новый природный,эпизоотический вариант апатогенного вируса гриппа(46). Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06 Иммунная сыворотка к референсному Гомологичный Титр антигемагглютининов к изоляту штамму титр А/лысуха/Актау/1454/06 А/утка/Чехословакия/1/56 (46) 5120 160 Примечания - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина 1 Н 3, Н 6-Н 16 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06 Изолят 1/Актау/1460/06 Примечания - - реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности. С диагностическими сыворотками к нейраминидазам вируса гриппа 2 - 9 получены отрицательные результаты. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа птиц подтипа 46 А/лысуха/Актау/1454/06,депонированный в коллекции микроорганизмов Научноисследовательского института проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии КН МОН РК под номером М-808/Д,используемый для приготовления диагностических препаратов. Фиг.1. Сходство и различие 1700 нуклеотидов гена гемагглютинина вируса гриппа А/лысуха/Актау/1454/06 (1), А/утка/Чехословакия/56 (2), А/утка/Сибирь/378/01 (3), А/утка/Альберта/28/76