Штамм вируса гриппа птиц подтипа H5N1 А/лебедь-шипун/Актау/1460/06, используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ шипун/Актау/1460/06 с целью приготовления на его основе диагностических тест-систем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделенных изолятов вирусов гриппа А. Штамм вируса гриппа А/лебедьшипун/Актау/1460/06(51) по структуре гемагглютинина близок к эталону А/Вьетнам/2004(1256) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280), характеризуется термостабильным гемагглютинином, сохраняющим способность агглютинировать эритроциты курицы после прогревания при 56 С в течение 180 мин,репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 7,83 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии МОН РК за номером депозита М-5-08/Д. Предлагаемый вариант агглютинирует эритроциты кур, морской свинки, крупного рогатого скота, барана, мыши, кошки, козы, лошади,верблюда и человека 0 группы. Штамм вирус гриппа А/лебедьшипун/Актау/1460/06(51) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А птиц и обнаружения специфических антител в сыворотках крови.(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Саятов Марат Хусаинович Березин Владамир Элеазарович Богоявленский Андрей Павлинович Ишмухаметова Наиля Галивеевна Асанова Сауле Естаевна Даулбаева Клара Дакишевна Шахворостова Лариса Ивановна Коротецкий Илья Сергеевич Зайцева Ирина Алексеевна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ ПОДТИПА 51 А/ЛЕБЕДЬШИПУН/АКТАУ/1460/06,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения диагностических препаратов к вирусу гриппа А подтипа 51. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/лебедь 22598 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для научных целей и получения специфических тест-систем для диагностики высокопатогенной гриппозной инфекции диких и домашних птиц. Известен референсный вариант вируса гриппа А/Вьетнам/2004 подтипа 51, выделенный от погибшего больного в Юго-восточной Азии//.-2004.-. 53.- р. 97-103). В последующем до февраля 2007 г. вирус птичьего гриппа (51) поразил поголовье птиц в десяти странах и вызвал 275 случаев заболевания людей с 167 летальными исходами, что свидетельствует о возможности прямой передачи этого возбудителя от птиц к человеку (,//////58.7) и подтверждает роль домашней птицы как источника инфекции для населения. Секвенирование генов вирусов 51, выделенных от 5 лиц во Вьетнаме и в Таиланде, показало, что они имеют птичье происхождение, но никаких доказательств реассортации генов между ВГП и человека не получено. Считается, что возбудитель гриппа 51 продолжительное время, начиная с 1997 г., циркулировал среди домашних птиц в Юговосточной Азии и с тех пор значительно эволюционировал ( В.,,..//, 2006. . 312. .384-388). Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/лебедьшипун/Актау/1460/06(51),позволяющего использовать его в качестве диагностикума с целью выявления специфических антител в сыворотках крови при вакцинальном и естественном инфицировании птиц современными вариантами вируса гриппа А подтипа 51, а также для проведения фундаментальных молекулярнобиологических исследований. Технический результат обеспечивается изоляцией оригинального казахстанского варианта вируса гриппа(51) отличного от эталонных и ранее выделенных штаммов, и обладающим уникальными антигенными и биологическими характеристиками. Предлагаемый штамм А/лебедьшипун/Актау/1460/06 (51) представляет собой вирус в антигенном отношении родственный с референсными вариантами А/Вьетнам/2004 (51) и А/крачка/Ю. Африка/1/62 (53), с иммунными сыворотками к которым он взаимодействовал реакции торможения гемагглютинации до гомологичного титра в разведениях 11280 и 12560,соответственно. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина 1 Н 3, Н 6-Н 16 получены отрицательные результаты(табл. 1). Нейраминидаза нового изолята А/лебедьшипун/Актау/1460/06 отнесена к подтипу 1 содержащими антитела к нейраминидазам вируса гриппа 2 - 9 получены отрицательные результаты. Новый штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов ДГП НИИ проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии МОН Республики Казахстан(депозит М-5-08/Д от 11.03.2008). Антигенная структура. Выделенный штамм изучали в реакциях торможения гемагглютинации и подавления нейраминидазной активности с использованием набора референс-сывороток к вирусам гриппа с подтипами гемагглютининов 116 и нейраминидазы 1-9 (табл. 1, 2). Результаты, представленные в таблицах 1 и 2,показывают,что штамм А/лебедьшипун/Актау/1460/06 имеет антигенную формулу 51. Более детальная антигенная характеристика этого вируса дана с помощью определения нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина методом секвенирования. Результаты сравнительного анализа 1703 нуклеотидов гена гемагглютинина, представленные на фиг.1, показывают, что штамм А/лебедьшипун/Актау/1460/06 отличается от ранее выделенного на территории Казахстана штамма 51 А/гусь/Павлодар/1/05 на 7,3 от вирусов А/Вьетнам/1194/2004 на 7,1, А/Вьетнам/1203/2004(51) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 7,83 ЭИД 50/0,2 мл. Штамм характеризуется высокой гемагглютинирующей (1256) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280). Свойства агглютинации. Исследуемый штамм в среднегеометрических титрах 8,00,0 - 11,70,6 агглютинирует эритроциты кур, морской свинки,крупного рогатого скота, барана, мыши, кошки,козы, лошади, верблюда и человека 0 группы. Терморезистентность. Предлагаемый штамм обладает термостабильным гемагглютинином,поскольку сохранял способность вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 180 мин. Ингибиторочувствительность. Штамм А/лебедьшипун/Актау/1460/06(51) оказался резистентным к неспецифическим ингибиторам сывороток крови курицы, мор.свинки, кролика,барана, лошади, крупного рогатого скота, человека и взаимодействовавал только с прогретой до 100 С сывороткой крысы. Элюирующая активность. По скорости элюции с нативных куриных эритроцитов исследуемый штамм относится к умеренно элюирующему варианту, так как полностью элюировал через 120 мин инкубации при 37 С. Патогенность. Штамм А/лебедьшипун/Актау/1460/06(51) отнесен к высокопатогенному варианту вируса гриппа(51). Интравенозный индекс патогенности для шестинедельных цыплят составляет 1,77. К выделенному штамму А/лебедьшипун/Актау/1460/06 (51) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы шиншила массой 2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 7 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 11280. Таким образом,сравнительное изучение казахстанского штамма вируса гриппа А/лебедь шипун/Актау/1460/06 (51) с другими штаммами вируса этого подтипа - А/Вьетнам/1194/2004,А/Вьетнам/1203/2004,А/гусь/Павлодар/1/05,А/лебедь-шипун/Актау/1460/06,А/крачка/Южная Африка/61 позволило выявить различия между ними по нуклеотидному составу важнейшего поверхностного антигена - гемагглютинина. Выявленные отличия указывают на то, что вирус А/лебедь-шипун/Актау/1460/06(51) не идентичен эталонным и ранее выделенным штаммам вируса гриппа А подтипа 51, а является новым природным, эпизоотическим вариантом высокопатогенного вируса гриппа(51). Приготовленные на его основе диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/лебедьшипун/Актау/1460/06 Иммунная сыворотка к референсному Гомологичный Титр антител к изоляту А/лебедьштамму титр шипун/Актау/1460/06 А/крачка/Ю. Африка/1/62 (53) 2560 2560 А/индюк/Онтарио/7732/66 (59) 640 80 А/утка/Гонконг/205/77 (52) 320 160 А/индюк/Англия/50/92 (51) 640 320 А/страус/Дания/72420/96 (52) 640 320 А/Вьетнам/2004 (51) 1280 1280 Примечания - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина Н 1 Н 3, Н 6-Н 16 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/лебедьшипун/Актау/1460/06 Изолят/Актау/1460/06 Примечания -- реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности. С диагностическими сыворотками к нейраминидазам вируса гриппа 2 - 9 получены отрицательные результаты. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа птиц подтипа 51 А/лебедь-шипун/Актау/1460/06, депонированный в коллекции микроорганизмов Научно исследовательского института проблем биологической безопасности Национального центра по биотехнологии КН МОН РК под номером М-5-08/Д, используемый для приготовления диагностических препаратов. Фиг.1 Сходство и различие 1703 нуклеотидов гена гемагглютина вируса гриппа А/Вьетнам/1194/04 (1),А/Вьетнам/1203/ (2) А/гусь/Павлодар/1/05 (3), А/лебедь-шипун/Актау/1460/06 (4), А/крачка/Южная Африка/61(5).