Штамм диплоидной культуры клеток эмбриональных фибробластов человека ФЭЧ 2/09 для регенеративной медицины

(51) 12 5/06 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ питательной среде ДМЕМ, содержащей 10 ЭТС,50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при температуре 37 и 5 СО 2. Посевная доза составляет 1,2-1,5 х 105 клеток в 1 мл, кратность рассева 12. Частота пассирования 1-2 раза в неделю. Морфологические исследования показали, что культура представлена фибробластоподобными(веретеновидными) клетками. При контроле на присутствие контаминантов микоплазма в клетках не обнаружена. Отсутствие бактерий, грибов и дрожжей подтверждено посевом на мясо-пептонный бульон, тиогликолевую среду и среду Сабуро. ПЦР-анализ и ИФА-метод не выявили вирусных и других посторонних агентов,включая ВИЧ, гепатиты А, В, С, , , ЦМВ, вирус Эпштейн-Барра, хламидии, туберкулез. Кариологический анализ показал, что кариотип фибробластов кожно-мышечной ткани эмбриона человека стабилен структурных нарушений нет,соответствует нормальному мужскому 46, ХУ. Клетки имеют диплоидный набор хромосом. Модальный класс четко выражен и представлен в основном клетками с 46 хромосомами. При определении онкогенных потенций с помощью метода подкожных гетеротрансплантаций штамма диплоидных фибробластов ФЭЧ-2/09 иммунодефицитным мышампоказано, что патологических изменений и образования тератом не наблюдалось.(72) Данлыбаева Газиза Аятбековна Огай Вячеслав Борисович Каюпов Болат Амангельдиевич Кумашева Венера Тулегеновна Аманжолов Рустам Адилевич Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ДИПЛОИДНОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА ФЭЧ 2/09 ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ(57) Изобретение относится к биологии, медицине,ветеринарии и косметологии и может быть использовано при создании банков новых отечественных аттестованных штаммов диплоидных клеток человека, а также для восстановления и корректировки функций поврежденных тканей путем трансплантации клеток из здоровых органов,выращенных в условияхи сохраняющих свои физиологические функции при соответствующих условиях культивирования. Штамм эмбриональных диплоидных клеток ФЭЧ 2/09 получили методом механической и дробной щадящей трипсинизации из кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Культивирование проводилось в 25091 Изобретение относится к биологии, медицине,ветеринарии и косметологии и может быть использовано при создании банков новых отечественных аттестованных штаммов диплоидных клеток человека, а также для восстановления и корректировки функций поврежденных тканей путем трансплантации клеток из здоровых органов,выращенных в условияхи сохраняющих свои физиологические функции при соответствующих условиях культивирования. Диплоидные клетки человека широко используются в биологии и медицине. Штаммы диплоидных клеток характеризуются доказанным ограниченным сроком жизни. Впервые об этом было сообщено 50 лет назад.,. - .,1961, 3.- . 155-173, которые показали, что диплоидные эмбриональные фибробласты легкого человека могут культивироваться в течение короткого периода времени и испытывают ограниченное, фиксированное число (50-60) удвоений популяций. К тому же диплоидная культура является морфологически однородной популяцией клеток, стабилизированной в процессе культивирования сохраняет в пассажах кариотип,характерный исходной ткани свободна от контаминантов и не обладает онкогенными потенциями. В литературе описаны методы получения и аттестации диплоидных клеток. Получено большое количество диплоидных штаммов из различных тканей и органов человека и животных. Однако лишь немногие из них соответствуют современным требованиям Международного Комитета ВОЗ по клеточным культурам и разрешены для использования в качестве субстрата для производства медицинских иммунобиологических препаратов и применения в регенеративной медицине. Известны штаммы диплоидных клеток легкого эмбриона человека -38 и -5, полученные в США.,.. ., 1961, 3, . 155-173. Штаммы используются для лабораторных исследований и в производстве вирусных вакцин. Данные о применении диплоидных клеток -38 и-5 в заместительной терапии в литературе не встречаются. К заявляемому изобретению близок штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81),используемый для диагностики вирусных инфекций Авторское свидетельство СССР 1147748, МПК С 12 7/00, опубл. 30.03.1985 г Штамм получен из ткани легкого 12 недельного эмбриона человека путем дробной щадящей трипсинизации кусочков ткани в 0,25 ном растворе трипсина. Диплоидный штамм накоплен в результате культивирования и заложен на хранение в количестве 150 ампул в период от 4 до 11-го пассажа. Указанные диплоидные клетки ЛЭЧ-4(81) использовались в качестве клеточной культуры для заместительной терапии Патент РФ 2 2213775, МПК С 12 5/08, опубл. 10.10.2003 г Известно,что за более 20-летний срок использования этих клеток, их ресурс значительно ограничен. Имеется штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-22, используемый для культивирования вирусов Патент РФ 1317021,опубл. 1993 г. и в заместительной терапии. Способ хирургического лечения воспалительных заболеваний пародонта, включающий отслаивание слизисто-надкостничных лоскутов с их одномоментной деэпитализацией,удаление грануляций и поддесневых зубных отложений,антисептическую обработку раневых поверхностей,имплантирование в костные дефекты остеопластического материала предполагает использование взвеси клеток линии М-22 диплоидных фибробластов кожи и мышц эмбриона человека, которые культивируют на среде Игла с добавлением 10-ной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) Цитология- 2001- Т. 43.- 9.- с. 853854. Наиболее близок к заявляемому изобретению штамм диплоидных клеток человека для заместительной терапии, представленный двумя вариантами из ткани легкого и кожно-мышечной ткани эмбриона Патент РФ 2285040, МПК 12 5/08, опубл. 10.10.2006 г Полученные в ходе механической и ферментативной диссоциации тканей, штаммы могут быть использованы при корреляции патологических процессов в организме путем трансплантации. Однако все эти штаммы являются дорогостоящими, приобретение их сопряжено с рядом трудностей,основные из которых обусловлены затратами на транспортировку и таможенные расходы. В результате поиска по источникам патентной и научно-технической информации не выявлено сведений о новых аттестованных штаммах диплоидных клеток кожномышечной ткани эмбриона человека, аналогичных заявляемому. Цель предлагаемого изобретения создание новых отечественных охарактеризованных штаммов диплоидных клеток человека для регенеративной медицины. Технической задачей изобретения является получение и характеризация штамма диплоидных культур клеток ФЭЧ 2/09. Штамм диплоидных клеток человека из кожномышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 2/09 зарегистрирован в Республиканской коллекции микроорганизмов под номером - 0300. Штамм получают следующим образом. Штамм диплоидных клеток получают из кожномышечной ткани 14-18 недельных эмбрионов, в результате индуцированного мифепристоном аборта по социальным показаниям у женщин, которые не имеют онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий. Первичный биоматериал, а также сыворотку крови женщин предварительно исследуют на отсутствие вирусов 25091 иммунодефицита человека, папилломы, краснухи,цитомегаловируса, гепатитов А, В, С,и , герпеса 1, 2 и 6 типов, Эпштейн- Барра, гонореи, хламидий,уреаплазмы, микоплазмы, сифилиса, туберкулеза,токсоплазмоза с помощью методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции. Кожно-мышечную ткань с соблюдением правил асептики механически очищают от мелких кровеносных сосудов, промывают в растворе Хенкса с добавлением антибиотиков, измельчают и помещают в теплую смесь 0,25-ного раствора трипсина и 0,02 раствора Версена при температуре 37 на 30 минут. Проводят 3 цикла дезагрегации со сменой среды, полученную взвесь,фильтруют и центрифугируют,осадок ресуспендируют в питательной среде ДМЕМ. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят до концентрации 23105 клеток в 1 мл питательной средой ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов коровы и переносят во флаконы для культивирования. Клетки культивируют при температуре 37, через сутки после посева проводят смену среды. После образования монослоя клетки снимают со стекла смесью 0,25-ного раствора трипсина и 0,02-ного раствора Версена, ресуспендируют в питательной среде и рассевают в культуральные флаконы. Дальнейшее субкультивирование проводят на 3-4 сутки с коэффициентом разведения суспензии 12 в фазе активного роста. После стабилизации культуральных свойств через 4-5 последовательных пассажей суспензию культуры клеток или культуральную жидкость исследуют на микробиологическую стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов. При отсутствии контаминации культуру клеток накапливают в процессе культивирования и на 6-ом пассаже замораживают. Аттестацию диплоидных штаммов ФЭЧ 2/09 проводят согласно требованиям ВОЗ,предъявляемым к клеточным линиям - субстратам производства медицинских иммунобиологических препаратов., 2003. В процессе работы исследуют морфологические характеристики,культуральные свойства, кариологию, отсутствие посторонних агентов (контаминантов), онкогенные потенции. Штамм характеризуется следующими признаками Морфологическая характеристика. Культура клеток представлена фибробластоподобными клетками с четкими границами и веретеновидной морфологией. Цитоплазма с характерной гомогенной мелкой зернистостью, ядро овальной формы, содержит 1-3 крупных ядрышка. Клетки прозрачны, расположены параллельными группами,ориентированными в различных направлениях. Рисунок культуры определяется контактной ингибицией роста, характерной для нормальных клеток, и не меняется в течение периода активной пролиферации. Культуральные свойства. Фибробласты выращивают в питательной среде ДМЕМ с добавлением 10 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Клетки субстрат-зависимы. Характер роста - стационарная монослойная культура. Пассирование клеток проводят с помощью смеси 0,25 раствора трипсина и 0,02 раствора Версена. Кратность рассева 12, посевная концентрация составляет 1,5-2 х 105 клеток в 1 мл. Частота пассирования -1-2 раза в неделю. Кариологический анализ. Кариологический анализ проводят на уровне 10-го и 30-го пассажа. Распределение числа хромосом определяют подсчетом числа хромосом в 30-50 метафазных пластинках. Культуру клеток выращивают 48-72 часа в матрасе при 37 до образования монослоя. Перед фиксацией клетки проверяют на наличие метафаз под световым микроскопом. В культуру клеток, содержащих достаточное количество метафаз, добавляют этидиум бромид в количестве 5 мкл/мл (сток 1 мг/мл) и выдерживают 15 минут при 37. После чего добавляют колцемид 1 мкл/мл(сток 1000 х) на 2-4 часа и инкубируют при 37. После экспозиции в колцемиде клетки отмывают и трипсинизируют 0,25 раствором трипсина,содержащим 0,02 Версена в течение 5 минут при 37. Клетки снимают со стекла встряхиванием или пипеткой Пастера, трипсин инактивируют большим количеством среды, переливают суспензию в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. На осадок клеток наливают теплый гипотонический раствор 0,56 М ,аккуратно перемешивают и инкубируют 15 минут при 37. Сливают гипотонический раствор,оставляя осадок. Клетки фиксируют свежеприготовленным фиксирующим раствором(13, метанол ледяная уксусная кислота). После фиксации ресуспендированные клетки наносят на чистые и влажные предметные стекла и высушивают на воздухе или феном. Готовые препараты проверяют под микроскопом. При наличии метафаз препараты окрашивают азурэозином по Романовскому или(4,6 диамидино-2-фенилиндол). Кариотип диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека стабилен, соответствует нормальному мужскому кариотипу человека, 246,ХУ. Клетки имеют диплоидный набор хромосом. Основной набор состоит из хромосом с 1-й по 23-ю пару. Модальный класс четко выражен и представлен в основном клетками с 46 хромосомами. Контроль контаминации. Диплоидные клетки исследуют на стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов. Микробиологическую стерильность определяют методом прямого посева культуральной жидкости на селективные питательные среды тиогликолевую среду, мясо-пептонный бульон,мясо-пептонный агар и жидкую среду Сабуро. Показано, что штамм диплоидных фибробластов 3 25091 свободен от бактерий, грибов и дрожжей. Отсутствие микоплазм подтверждено люминесцентной микроскопией в сочетании с окраской ДНК-специфичными флюорохромами 0,002 раствором оливомицина или 0,0005 раствором -33258 и полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Контроль на отсутствие посторонних вирусов проводят в реакции гемадсорбции,иммуноферментным методом (ИФА) и ПЦР. Реакцию гемадсорбции проводят с 0,25 взвесью эритроцитов кур и 0,25 эритроцитов человека 0(1) группы. Для этого из флаконов с клеточной культурой сливают культуральную жидкость,монослой дважды отмывают раствором Хэнкса. Затем во флакон вносят взвесь эритроцитов в объеме достаточном, чтобы покрыть весь монослой. Клетки инкубируют 30 мин при температуре 37,затем еще 30 мин при комнатной температуре. По истечении этого времени, эритроциты удаляют из флаконов, трижды отмывая монослой раствором Хэнкса, затем исследуют под инвертированным микроскопом. Тестирование не выявило гемагглютинирующих и гемадсорбирующих вирусов в диплоидных клетках ФЭЧ 2/09, что в дальнейшем подтверждено ИФА-анализом. При аттестации полученного штамма диплоидных клеток эмбриона человека использовали высокочувствительный метод ПЦР. Данный метод позволяет выявить наиболее распространенные и изученные виды инфекционных возбудителей. Впервые для определения посторонних контаминантов в диплоидной культуре ФЭЧ 2/09 использовали комплексный ПЦР-анализ с применением праймеров к 25 возбудителям,,, В , , ,и вирусу Эпштейн-Барра. Проведенный контроль не выявил вышеприведенных патогенов в диплоидных клетках ФЭЧ 2/09. Криоконсервация. После проведения контролей и наработки достаточного количества клетки ампулируют и криоконсервируют. Для этого клеточный монослой снимают со стекла смесью 0,25 раствора трипсина и 0,02 раствора Версена и центрифугируют. К осадку клеток добавляют эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), и затем диметилсульфоксид или глицерин до конечной концентрации 10. Проводят подсчет жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 1106 клеток в объеме 1 мл. Ампулы герметизируют, маркируют,помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70, а затем переносят в жидкий азот. 4 Температура длительного хранения клеток составляет - 196. Условия размораживания. Для восстановления диплоидных клеток после криоконсервации ампулу с замороженной суспензией быстро помещают в водяную баню при 37. После размораживания взвесь клеток переносят стерильно в пробирку,содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды или раствора Хэнкса, отмывают один раз,центрифугируя клетки при 1500 об/мин в течение 5 минут, и засевают в культуральные флаконы с питательной средой ДМЕМ и 10 ЭТС. Либо ампулу с размороженной суспензией вскрывают в условиях стерильности, взвесь клеток переносят в культуральные флаконы,ресуспендируют,добавляют питательную среду ДМЕМ и 10 сыворотки ЭТС. Проводят подсчет жизнеспособных клеток. Жизнеспособность культуры после размораживания составляет не менее 75 (705). Концентрация клеток для рассева составляет 2,0-3,0 х 10 5 в 1 мл. Клетки культивируют при температуре 37 в атмосфере 5 СО 2. На следующие сутки производят полную замену среды и продолжают культивировать до образования полного монослоя. Иммуноцитохимический анализ. Для проведения анализа используют набор первичных антител поликлональные кроличьи антитела к коллагенутипа, фибронектину, моноклональные мышиные антитела к ламину А/С и вторичные антитела,конъюгированные с флюорохромом 555. Иммуноцитохимический анализ показал, что культура диплоидных клеток ФЭЧ 2/09 экспрессирует белки,характерные для фибробластов - коллагентипа и фибронектин, а также маркер дифференцированных клеток - ламин А/С. Контроль онкогенных потенций. Тестирование туморогенности проводят с помощью метода подкожной гетеротрансплантации диплоидных клеток иммунодефицитным мышам с мутацией. Наблюдения за животными проводят в течение 5-6 недель. Проведено 8 подкожных инъекций линии ФЭЧ-2/09 с 8 по 18 пассажи с интервалом в 10-12 дней. Показано, что патологических изменений в месте введения, то есть образования тератом не наблюдалось. Изобретение иллюстрируется следующим примерами. Пример 1. Фетальные ткани получают из гинекологических отделений, помещают в раствор Хэнкса с антибиотиками(пенициллин и стрептомицин по 500 Ед/мл) и доставляют в лабораторию. Кожно-мышечную ткань с соблюдением правил асептики механически очищают от мелких кровеносных сосудов,тщательно отмывают от эритроцитов в растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков, измельчают и помещают в теплую смесь 0,25-ного раствора трипсина и 0,02 раствора Версена при температуре 37 на 30 минут. По истечении времени фермент сливают. Во флакон с тканью помещают стерильный стержень-магнит, наливают 25091 солевой раствор и помещают флакон на магнитную мешалку. Проводят 3 цикла дезагрегации по 5 минут со сменой среды, полученную взвесь после каждого цикла сливают, куда добавляют по 2-3 мл сыворотки для инактивации остатков фермента, затем все 3 пула объединяют, фильтруют и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в питательной среде ДМЕМ с антибиотиками. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят до концентрации 2-3105 клеток в 1 мл питательной средой ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов коровы и переносят во флаконы для культивирования. Клетки культивируют при температуре 37, через сутки после посева проводят смену среды. После образования монослоя клетки снимают со стекла смесью 0,25-ного раствора трипсина и 0,02-ного раствора Версена, ресуспендируют в питательной среде и рассевают в культуральные флаконы. Дальнейшее субкультивирование проводят на 3-4 сутки с коэффициентом разведения суспензии 12 в фазе активного роста. Пример 2. Для получения посевного банка диплоидных фибробластов восстанавливают клетки,замороженные на 6 пассаже. Для этого ампулу с замороженными клетками оттаивают, вскрывают в стерильных условиях, суспензию переносят в культуральный флакон,добавляют полную питательную среду ДМЕМ с 10 ЭТС и инкубируют при температуре 37 и в атмосфере 5 СО 2, проводят 5 последовательных пассажей с коэффициентом рассева 12. Клетки замораживают на уровне 11 пассажа в количестве 150 ампул(посевной банк). Рабочий банк получают из посевного банка, клетки культивируют до получения необходимого объема и замораживают на уровне 15 пассажа в количестве 150 ампул. Пример 3. Для проведения иммунофлуоресцентного анализа фибробластов эмбриона человека используют следущие антитела поликлональные кроличьи антитела против коллагенатипа, 11000 поликлональные кроличьи антитела против фибронектина, 11000 мышиные антитела против ламина А/С, 1150. Для проведения анализа клетки высаживают в чашки Петри(диаметром 3,5 см), на дне которых находится покровное стекло размером 2222 мм. После прикрепления клетки фиксируют свежеприготовленным раствором 3 параформальдегида в фосфатном буфере(1,7 М 24,5,224, 150 М ). После трехминутной обработки 0,1 тритоном Х-100 вклетки отмывают три раза по 5 мин . Для блокирования неспецифического взаимодействия антител клетки инкубируют в течение 25 мин с 2 раствором бычьего сывороточного альбумина в. Для приготовления раствора первичных и вторичных антител необходимой концентрации,основной раствор антител разводят в ,содержащем 1 альбумина и 0,120. Инкубирование в растворе первичных антител проводят при комнатной температуре в течение одного часа. После трех пятиминутных отмывок в растворе 0,220 в , наносят раствор вторичных антител,конъюгированных с флюорохромом, и инкубируют препараты 45 минут при комнатной температуре в темноте. Клетки отмывают от раствора вторичных антител три раза по пять минут раствором 0,220 в , два раза в 2-кратном стандартном солевом творе(0,3 М , 0,3 М цитрат натрия). Ядра клеток подкрашивают раствором(в концентрации 210-3 мкг/мл) в 2, в течение 4 мин в темноте, промывают два раза по 5 минут в 2, и в воде, и сушат на воздухе в темноте. После высушивания, под покровное стекло наносят по 10 мкл антивыгорающего раствора (антифэйда),содержащего 90 глицерина, 0,1 М - 23 мг/мл(1,4-диаза-бицикло(2,2,2)октан). Препараты анализируют с помощью флюоресцентного микроскопа. В результате выявлено, что клетки ФЭЧ 2/09 экспрессируют следующие белки - коллагентипа, фибронектин и ламин А/С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм диплоидной культуры клеток эмбриональных фибробластов человека ФЭЧ 2/09,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК, под номером