Способ определения плотности клеток в суспензии культуры клеток SOLANUM TUBEROSUM

(51) 12 5/02 (2006.01) 01 21/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано при характеризации культур растительных клеток. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении точности определения плотности культуры растительных клеток, снижении трудозатрат и затрат времени на проведение испытания. Способ определения плотности клеток в суспензии культуры клеток,включающий окрашивание клеток и определение их количества в суспензии на основании их способности сорбировать краситель достигается тем, что определение плотности клеток проводят спектрофотометрическим методом, в качестве красителя используют метиленовый синий, избыток которого после окрашивания отмывают водой,отфильтрованные окрашенные клетки экстрагируют этиловым спиртом, в полученных экстрактах красителя измеряют адсорбцию света при длине волны 660 нм.(72) Михалев Александр Николаевич Сапко Ольга Александровна Утарбаева Айжан Шарельевна Жабаева Динара Болатпековна Кунаева Рауза Минлиахмедовна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Под ред. Бутенко Р.Г. Биотехнология растений культура клеток. - М. Агропромиздат, 1989, с.280(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК(57) Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть 21862 Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано при характеризации культур растительных клеток. Известен способ определения плотности клеток в суспензии культуры растительных клеток,включающий окрашивание клеток и определение их количества в суспензии на основании их способности сорбировать краситель и визуальный подсчет количества клеток в поле зрения микроскопа (Под ред. Бутенко Р.Г. Биотехнология растений культура клеток. - М. Агропромиздат,1989,с.280). Недостатком данного способа является то, что метод требует длительного времени для исполнения и значительных трудозатрат, а также мало пригоден при анализе культур клеток с повышенной степенью агрегации. Задачей изобретения является разработка быстрого, точного, с минимальными трудозатратами и затратами рабочего времени метода определения плотности клеток в суспензии культуры растительных клеток, в том числе агрегированных культур. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении точности определения плотности культуры растительных клеток, снижении трудозатрат и затрат времени на проведение испытания. Это достигается тем, что в способе определения плотности клеток в суспензии культуры клеток, включающий окрашивание клеток и определение их количества в суспензии на основании их способности сорбировать краситель,отличающийся тем, что определение плотности клеток проводят спектрофотометрическим методом,в качестве красителя используют метиленовый синий, избыток которого после окрашивания отмывают водой, отфильтрованные окрашенные клетки экстрагируют этиловым спиртом, в полученных экстрактах красителя адсорбцию света при длине волны 660 нм. Поставленная задача, достигается тем, что на суспензию культуры клетоквоздействуют 0,1 водным раствором метиленового синего в соотношении 51 (/) в течение 5 мин,отмывают избыток красителя водой, отфильтрованные окрашенные клетки экстрагируют этиловым спиртом, в полученных экстрактах красителя измеряют адсорбцию света при длине волны 660 нм. Культуру клеток .используют для испытания средств защиты растений, ростстимулирующих веществ, цитотоксической активности паразитов картофеля и др. препаратов, для получения посадочного материала картофеля свободного от патогенов, для селекционных работ. Культуру клеток .культивируют на среде - при температуре 24-27 С на круговой качалке со скоростью 150 об./мин. Цикл выращивания составил 8-10 дней при исходной плотности 0,5-0,7105 кл/см 3. Пример 1. Культуру клеток .с циклом выращивания 7-8 дней при исходной плотности засева 0,5-0,7105 кл/см 3 и культивировании на модифицированной среде - при температуре 24-27 С анализировали в середине цикла выращивания (на 4-й день). В суспензии клеток .была вызвана тотальная гибель клеток путем инкубирования суспензии в 10 растворев течение 1 часа. Плотность клеток суспензии определяли подсчетом в гомоцитометре Фукса-Розенталя под микроскопом после мацерации суспензии 20 хромовой кислотой в течение 15 минут при температуре 60 С 1. При этом начальная плотность суспензии клеток составила 75000 кл/см 3. Пример 2. Из исходной суспензии был получен ряд разведений с приблизительной плотностью клеток 75000 кл/см 3 37500 кл/см 3 18750 кл/см 3 9375 кл/см 3 4688 кл/см 3 2344 кл/см 3. Полученные суспензии окрашивали путем добавления 0,1 раствора метиленового синего в соотношении 51 (/) и инкубирования с красителем в течение 5 мин. Окрашенные клетки отмывали от избытка красителя с помощью вакуум фильтрационной системы через мембранный фильтр три раза четырехкратным объемом дистиллированной воды. Клетки количественно собирали с мембранного фильтра и краситель экстрагировали этиловым спиртом при периодическом перемешивании в течение 15 минут. Клетки отделяли. Пример 3. В полученных окрашенных растворах измеряли адсорбцию света при длине волны 290 нм. Опыты воспроизведены дважды, в трехкратной повторности каждый. Средние арифметические значения были нанесены на график. Полученный график представлен на фиг. 1. Как видно из рисунка 1 суспензии с различным содержанием клеток образуют криволинейную зависимость между содержанием клеток в суспензии и значением адсорбции света при длине волны 290 нм в окрашенных растворах, полученных экстрагированием красителя метиленового синего из суспензии предварительно окрашенных клеток. Полученный график пригоден для использования его в качестве калибровочной кривой при определении плотности клеток суспензии. Пример 4. В полученных окрашенных растворах измеряли адсорбцию света при длине волны 330 нм. Опыты воспроизведены дважды, в трехкратной повторности каждый. Средние арифметические значения были нанесены на график. Полученный график представлен на фиг. 2. Как видно из рисунка 2 суспензии с различным содержанием клеток не образуют линейной зависимости между содержанием клеток в суспензии и значением адсорбции света при длине волны 330 нм в окрашенных растворах, полученных экстрагированием красителя метиленового синего из суспензии предварительно окрашенных клеток. Полученный график не позволяет использовать его в качестве калибровочной кривой при определении плотности клеток суспензии. Пример 5. В полученных окрашенных растворах измеряли адсорбцию света при длине волны 660 нм. 21862 Опыты воспроизведены дважды, в трехкратной повторности каждый. Средние арифметические значения были нанесены на график, где расположились вблизи дуговой линии. Через них методом линейного сглаживания была проведена калибровочная кривая (мастер диаграмм, мастер построения линии тренда). Полученная калибровочная кривая приведена на фиг. 3. Как видно из фиг.3 суспензии с различным содержанием клеток образуют линейную зависимость между процентным содержанием погибших клеток в смеси и значением адсорбции света при длине волны 660 нм в окрашенных растворах, полученных экстрагированием красителя метиленового синего из суспензии предварительно окрашенных клеток. Полученный график обладает преимуществом в амплитуде значений и крутизне наклона по сравнению с аналогичной кривой при длине волны 290 нм и позволяет использовать его в качестве калибровочной кривой при определении плотности клеток суспензии. Пример 6. Для проверки диагностической ценности спектрофотометрического метода было выращено 2 суспензии культуры клеток . . Первая суспензия была взята на 5 сутки роста. Вторая суспензия была взята на 4 сутки роста. Для каждой суспензии была определена плотность клеток. Плотность клеток суспензии определяли подсчетом в гомоцитометре Фукса-Розенталя после мацерации суспензии 20 хромовой кислотой в течение 15 минут при температуре 60 С. При этом первая суспезия имела плотность приблизительно 55000 кл/см 3. Вторая суспензия имела плотность приблизительно 30000 кл/см 3. Обе суспензии окрашивали путем добавления 0,1 раствора метиленового синего в соотношении 51 (/) и инкубирования с красителем в течение 5 мин. Окрашенные клетки отмывали от избытка красителя с помощью вакуум фильтрационной системы через мембранный фильтр три раза четырехкратным объемом дистиллированной воды. Клетки количественно собирали с мембранного фильтра и краситель экстрагировали этиловым спиртом при периодическом перемешивании в течение 15 минут. Клетки отделяли. В полученных окрашенных растворах измеряли адсорбцию света при длине волны 660 нм. Значения адсорбции света откладывали на графике калибровочной кривой и по шкале абсцисс определяли плотность клеток в суспензии (фиг. 4). Полученные данные приведены в таблице 1. Результаты спектрофотометрического определения плотности клеток в суспензии оказались в хорошем соответствии с микроскопическим определением. Таким образом, спектрофотометрический метод определения плотности культуры клеток существенно быстрее микроскопического и более достоверен при анализе агрегированных культур. Разработанный спектрофотометрический метод определения плотности представляет собой удобный вариант для серийных исследований. Таблица 1 Сравнительная проверка плотности суспензии культуры клеток.микроскопическим и спектрофотометрическим методами Суспензии культуры клеток . Определение плотности ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения плотности клеток в суспензии культуры клеток,включающий окрашивание клеток и определение их количества в суспензии на основании их способности сорбировать краситель, отличающийся тем, что определение плотности клеток проводят спектрофотометрическим методом, в качестве красителя используют метиленовый синий,избыток которого после окрашивания отмывают водой, отфильтрованные окрашенные клетки экстрагируют этиловым спиртом, в полученных экстрактах красителя измеряют адсорбцию света при длине волны 660 нм.