Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. “Mab/MCF – 3Д4″ – продуцент моноклональных антител к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы MCF – 7, используемый в качестве диагностического реагента для мониторинга онкозаболеваний

(51) 12 5/06 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирующих моноклональные антитела к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7 получали гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии / с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильштейна,(1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводили с использованием иммуноферментного анализа,иммуноблотинга и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., -продуцирует однородный по составу гомогенные препараты моноклональных антител, которые реагируют только с белковым антигеном опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7. Концентрация моноклональных антител достигает 125 мкг/мл в культуральной среде, а при прививке сингенным мышам(в асцитной жидкостей) - 8 мг/ мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 164, а в асцитной жидкости - 125600. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания (аффинность) моноклональных антител составляет 7,5108 М-1.(72) Ескендирова Сауле Зиядиновна Унышева Гульхан Бекбергеновна Казыкен Дубек Муканов Касым Касенович Мукантаев Канатбек Найзабекович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. / - 3 Д 4 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКОВОМУ АНТИГЕНУ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ- 7, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ МОНИТОРИНГА ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, а именно в экспериментальной и клинической онкологии для мониторинга течения онкозаболеваний и эффективности терапии,гистологической идентификации опухолей, раннего выявления и прогнозирования развития опухолей. 21863 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, а именно в экспериментальной и клинической онкологии для мониторинга течения онкозаболеваний и эффективности терапии,гистологической идентификации опухолей, раннего выявления и прогнозирования развития опухолей. Антигенные отличия злокачественно трансформированной клетки от нормальной - ключевой вопрос иммунологии опухолей. Исследования в этом направлении позволяют выяснить не только механизмы малигнизации клетки, прогрессии опухоли и ускользания ее от иммунного надзора организма, но и вносят существенный вклад в клиническую онкологию. Статистические данные последних лет также свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы в различных странах. Многочисленные исследования выявили ряд специфических антигенов на поверхностной мембране и в цитоплазме опухолевых клеток, ассоциированных с раком молочной железы человека - антигены эпителиальных мембран СА 15-3, СА 15-5, СА 19-9,муциноподобный ассоциированный антиген МСА,тканевой полипептидный антиген ТПА,гликопротеидный антигенЛСА и т. д. Динамика уровня других онкомаркеров (онкофетальные антигены - РЭА, -фетопротеин, метаболические маркеры -ферритин, микроглобулин гормонов ХГЧ и АКТГ и ферментов - фосфатазы,лактатдегидрогеназы) также позволяет сделать заключение о природе прогрессирования данного онкозаболевания. (М.А. Алексеева, и соавт. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностического использования. Проблемы репродукции, 3.2005, с. 65-77., . .... 2007. 30. . 1-32. Моноклональные антитела (МКА) сегодня необходимый атрибут лаборатории, производящей современные диагностические тест-системы. В отличие от поликлональных гетерогенных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью,аффинитетом и физико-химическими свойствами,препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физико-химическими характеристиками и сродством к антигену Известен штамм гибридомы 15 А 8,продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к белковому эпитопу плазматической мембраны аденокарциномы молочной железы- 7. (., . , . ..5032521.1991.) Мыши были иммунизированы внутрибрюшинно живыми опухолевыми клетками в концентрации 1106 трехкратно с интервалом неделю. Тестирование и отбор позитивных гибридом осуществляли методом ИФА. Данный антиген был выявлен в 28 их 31 злокачественных опухолей молочной железы. Наличие антигена успешно обнаруживали при различных гистологических типах рака молочной железы, в т.ч. первично инфильтративной протоковой карциноме - 87, инфильтративнопротоковой карциноме с метастазами.- 100,внутрипротоковой карциноме-100, гиперплазии и фиброаденоме молочной железы -100. При исследовании 18 малигнизированных тканей другой локализации (меланома, мезотелиома, лимфома,карциномы легкого, кишечника, яичника, мочевого пузыря и т.д.) отмечено отсутствие экспрессии антигена. Однако МКА связывались с нормальными эпителиальными клетками молочной железы,эпидермиса кожи, пищевода, слюнных желез. По мнению авторов, антиген с молекулярной массой 22 кДа присутствует в норме на клеточных мембранах эпителиальных клеток молочной железы и не подвергаются антигенному упрощению при малигнизации,сохраняясь в эпителиальных опухолях молочной железы,и поэтому использование данного МКА предполагается для дифференциации карциномы молочной железы от злокачественных новообразований другого тканевого происхождения. Высокая специфичность к опухолевым клеткам молочной железы была сообщена для трех типов МКА, которые реагировали с мембранным антигеном эпителиальных клеток молочной железы человека, представляющий собой гликопротеид с карбогидратным компонентом с молекулярной массой 330 кДа. (М. , В. , ..4960716. 1990.) МКА получены при иммунизации мышей фракцией клеточных мембран эпителиальных клеток молочной железы. Высокомолекулярный антиген был обнаружен в клеточных мембранах большого количества малигнизированных клеточных линий различного тканевого происхождения, но не обнаруживался в диплоидных клеточных штаммах человека. Экспрессия антигена варьировала при использовании 8 клеточных линии опухолей молочной железы. МКА позитивно окрашивали 20 срезов первичных опухолей с метастатическим поражением лимфоузлов и наиболее были выражены при инфильтративно-протоковых карциномах молочной железы. Испытуемые МКА не реагировали с фибробластоподобными опухолевыми клеточными линиями и слабо с лимфобластоидными линиями, но взаимодействовали с другими эпителиальными опухолевыми линиями. Повышенный уровень этого антигена определялся в плазме крови больных раком молочной железы. Радиоиммунологическим методом на основе МКА установлено, что у 76 больных содержание этого антигена в плазме крови составляет выше 150 ед./мл, а у 33 из 36 здоровых женщин - ниже 150 ед./мл. Поскольку высокое 21863 содержание антигена выявляли у 27 больных гепатомой и 47 больных раком яичников,определение этого антигена в плазме крови авторами изобретения было использовано лишь для контроля течения рака молочной железы. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг белкового антигена опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7, в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей,которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора,содержащего 45 полиэтил енгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксида и 45 -1640 к смеси состоящей из 4106 клеток -63.-85.6.3. и 20106 спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (Г). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием белкового антигена опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7 и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 90 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают / - 3 Д 4. Штамм гибридных клеток / - 3 Д 4 депонирован и хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан(010000, г. Астана, ул. Ш. Валиханова,43) под регистрационным номером- 0232 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2- Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 - 16 день. Доза клеток при прививке 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 5 день культивирования гибридомы, концентрация МКА достигает 125 мкг/мл в культуральной среде, а при прививке сингенным мышам (в асцитной жидкости)8 мг/мл. Титр МКА иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 164, а в асцитной жидкости 125600. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител по отношению к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7 составляет 7,510 8 М-1 Методы оценки специфичности МКА иммуноблотинг, непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Штамм гибридных культивируемых клеток 21863 Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью 25 см 2 по 2 х 105 клеток в 1 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на сингенных мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН - 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА в лунки 96-луночного планшета для культивирования вносят суспензию опухолевых клеток в питательной среде в концентрации 20-25 тыс. кл/мл. Затем планшет культивируют при 37 С 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют и производят фиксацию клеток 70 спиртом в течение 10 минут. Планшет отмывают четырехкратно ФСР, содержащим 0,1 тритона Х-100 (ФСР-Т), и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ-Т для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют и планшет отмывают вышеописанным способом. В лунках двух вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной(1100 и более) в 0,1 см 3 ФСР-Т. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ФСР-Т. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 рабочего разведения конъюгата в ФСР-Т. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 см 3 0,05 М ЦФР и добавляют 0,025 см 3 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 см 3 стоп - реагента. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темно-коричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают ее максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы /-7 - 3 Д 4 Наименование антигенов и клеточных линий человека Титр моноклональных антител в культуральной в асцитной жидкости жидкости Фракции плазматических белков 1128 125600 164 112800 РО РО Клеточные линии человека эпителиоподобная 132 13200 эпителиоподобная 21863 Как видно из таблицы, титры МКА в асцитной жидкости к фракции плазматических белков опухолевых клеточных линии -7 и -75-1 были достаточно высокими (125600 и 112800) и аналогичны титрам к интактным опухолевым клеткам,что свидетельствует о иммунодоминантности выявляемого антигена на клеточной мембране опухолевых линии. Взаимодействие МКА с клетками эпителиальных опухолевых линии разного происхождения и отсутствие реакции с нормальными клеточными линиями обусловливает возможность обнаружения белкового антигена как маркера, ассоциированного со злокачественным перерождением эпителиальной ткани. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы/ - 3 Д 4 к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7, что обуславливает возможность их использования как высокочувствительных и специфичных реагентов для диагностики онкозаболеваний. Пример 3. Образцы фракции плазматических белков опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы- 7 в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 10-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофореграмму переносят на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,27,4 (18 ч при 4 С или 2 ч при 37 С), затем отмывают по 3 раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37 С с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1100 ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител,меченных пероксидазой (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1-нафтола. Иммунохимическое проявление фракций плазматических белков клеточной мембраны опухолевых клеток -7 методом иммуноблотинга с применением моноклональных антител и антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена, показало специфичность моноклональных антител к эпитопам белка, моле-кулярная масса которого соответствовала 200 кДа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. / -3 Д 4 продуцент моноклональных антител к белковому антигену опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы -7, депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК- 0232, используемый в качестве диагностического реагента для мониторинга онкозаболеваний.