Штамм вируса гриппа птиц а/озерная чайка/атырау/4378/10(н1n2), используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 21 7/00 (2006.01) 61 39/145 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ гемагглютинина близок к вирусу///0224-06/2011 (12), отличается от А/красноносый нырок/Балхаш/4523/201(12) аминокислотной заменой 39 и от референсного штамма А/утка/Альберта/35/1976(11) заменами Аа 15 е, 44 и 99. По М-гену вирус А/озерная чайка/Атырау/4378/2010 (12) входит в кластер чайковой линии, сформированной в основном вирусами с подтипом НА Н 13. Штамм А/красноносый нырок/Балхаш/4523/201(12) относится к кластеру вирусов с НА Н 1, Н 8, 11 европейской птичьей линии, выделенных в Корее и на юге Китая в 2003-2007 гг. Штамм репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 5,75 ЭИД 50/0,2 мл,обладает высокой гемагглютинирующей (1512) и иммуногенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА -11280, термостабильным гемагглютинином,хорошо агглютинирует эритроциты различных видов животных и человека 0 группы, характеризуется высокой скоростью элюции с эритроцитов кур,проявляет ингибиторорезистентность к нативным и прогретым сывороткам крови курицы, морской свинки, крысы,кролика, барана и лошади. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов РГП на ПХВ НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК за номером депозита М-2-13/Д. Предлагаемый штамм рекомендуется для приготовления диагностических препаратов (антигена, иммунной сыворотки, тестсистемы), которые могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпизоотических вспышек гриппа и оценки напряженности популяционного иммунитета у диких и домашних птиц.(72) Кыдырманов Айдын Исагалиевич Даулбаева Клара Дакишевна Карамендин Кобей Омертаевич Асанова Сауле Естаевна Саятов Марат Хусаинович Касымбеков Ермухаммет Торебекович Жуматов Кайнар Хамзаевич Хан Елизавета Яковлевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Кадырманов А.И.,Саятов М.Х.,Карамендин К.О. И др. Филогенетическая характеристика казахстанских изолятов вируса гриппа диких птиц 12. Материалы международной научно-практической конференции Актуальные проблемы вирусологии,микробиологии,гигиены и эпидемиологии,иммунобиологии. Алматы, с.56-61, 2012.(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ А/ОЗЕРНАЯ ЧАЙКА/АТЫРАУ/4378/10(Н 12),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при создании тестсистем для диагностики гриппозной инфекции птиц,а также проведения фундаментальных молекулярно - биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (12) с целью приготовления на его основе тест-систем для диагностики вируса гриппа с подтипом НА Н 1 и выявления к нему специфических антител в сыворотках крови птиц. Штамм вируса гриппа А/озерная чайка/Атырау/4378/10 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при создании тест-систем для диагностики гриппозной инфекции птиц, а также проведения фундаментальных молекулярно биологических исследований. Наличие природного резервуара вирусов гриппа А рода А),поддерживаемого птицами водного и околоводного комплексов,а также некоторыми видами млекопитающих, определяет риск формирования новых антигенных вариантов, в том числе с высоким эпидемическим потенциалом, что было подтверждено развитием пандемий прошлого столетия. Вирусы гриппа А гемагглютинином (НА) Н 1 явились причиной возникновения трех пандемий испанского гриппа 1918-1919 гг.,русского гриппа 1978-1979 гг., а также новой пандемией 2009 г., вызванной реассортантом двух свиных вирусов американского и евразийского кластеров 6 сегментов он пробрел (РВ 2, РВ 1, РА,НА,и ) от американского, а дваи М от евразийского. Как и у всех вирусов гриппа А, в нем присутствует генетический материал от птичьих вирусов,.,..-(11)//. . . 2009 361.// 2009. . 361. . 279-285. Львов Д.К. Новые и возвращающиеся инфекции северной Евразии - глобальные последствия // Вестник РАМН.- М.-Медицина. 2011. 5. .5-12. Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Меркулова Л.Н. и др. Этиотропная терапия гриппа Уроки последней пандемии // Вестник РАМН. М. Медицина. 2011. 5. .35-40 В связи с этим прогностическое значение может иметь надзор за циркуляцией вирусов, включающий изоляцию и идентификацию эпидемических штаммов,изучение их биологических и молекулярно-генетических свойств, а также оперативное выявление новых антигенных серовариантов. Задачей изобретения является получение нового штамма А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (12) с целью приготовления на его основе тест-систем для диагностики вируса гриппа с подтипом НА Н 1 и выявлении к нему специфических антител в сыворотках крови птиц. В 2010 г. на атырауском побережье Каспия(Западный Казахстан) из помета озерной чайки выделен штамм вируса гриппа А/озерная чайка/Атырау/4378/10 Кыдырманов А.И.,Саятов М.Х.,Карамендин К.О. и др. Филогенетическая характеристика казахстанских изолятов вируса гриппа диких птиц 12 // Мат-лы межд. науч.-практич. конф. Актуальные пробл. вирусол., микробиол гигиены, эпидемиол. и иммунобиол. К 100-летию акад. АН КАЗ ССР,д.м.н., проф.Ж. Жуматова. Алматы, 19 окт. 2012 г.///35/76 (11) и А/// 1/2009 (12), с иммунными сыворотками к которым в РТГА он взаимодействовал до 1/2-1/4 2(1640,11280. Со специфическими сыворотками к вирусам с подтипамиН 2-Н 16 получены отрицательные результаты (табл. 1). Ферментативная активность изолята А/озерная чайка/Атырау/4378/10 подавлялась моноспецифической сывороткой к 2, с диагностическими сыворотками, содержащими антитела к нейраминидазе 1, 3-9 получены отрицательные результаты (табл.2). Таким образом, результаты представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что штамм А/озерная чайка/Атырау/4378/2010 имеет антигенную формулу 12. Циркуляции вируса гриппа с подобным подтипом НА среди диких пернатых на территории Казахстана не отмечалось в последние 10 лет и его появление в популяциях водоплавающих птиц в регионе совпало с пандемией свиного гриппа 11 2009 г. Штамм депонирован и хранится в коллекциях микроорганизмов РГП на ПХВ НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК( депонента М-2-13/Д) и лаборатории экологии вирусов РГП на ПХВ Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК. Генетический анализ. Выделение вирусной РНК осуществляли с использованием набора( , )12.-2005 Обратную транскрипцию проводили с ревертазой(,) при помощи 12. Амплификацию кДНК выполняли с использованием праймеров, рекомендованных для секвенирования сегментов генома вирусов гриппа А Кыдырманов А.И., Саятов М.Х., Карамендин К.О. и др. Филогенетическая характеристика казахстанских изолятов вируса гриппа диких птиц 12 // Мат-лы межд. науч.-практич. конф. Актуальные пробл. вирусол., микробиол гигиены, эпидемиол. и иммунобиол. К 100-летию акад. АН КАЗ ССР,д.м.н., проф.Ж. Жуматова. Алматы, 19 окт. 2012 г. .56-61. и набора( , ,Германия). Для секвенирования кДНК использовали метод дидеоксисеквенирования по Сенгеру 12. 2005 Секвенирование ДНК проводили на автоматическом 96-капиллярном секвенаторе 3730,. Выравнивание секвенированных последовательностей генов казахстанского изолята вируса гриппа А с полными нуклеотидными последовательностями таковых вирусов американской и евразийской линий проводили по компьютерной программе. Филогенетический анализ и построение древ выполнены с помощью программы иверсии 4 методом присоединения соседей со значениямина основе 1000 повторов. Результаты сравнительного филогенетического анализа последовательностей генов показали, что казахстанский вирус А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (12), также как изолят А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) входят в кластер Н 1.1.2. В составе штамма А/озерная чайка Атырау/4378/10 (12) отсутствуют гены вирусов гриппа пандемического (А/Алматы/347/2009 11) и свиного (////2009-12) происхождений, которые представляют отдельную линию генетического кластера Н 1.3. В филогенетическом отношении казахстанский изолят вируса гриппа 12 относился к евразийской птичьей линии (филограмма 1). Наиболее близким из этой группы к вирусу А/озерная чайка/Атырау/4378/10 оказался изолят(12). циркулировавший в 2009-11 гг. в Китае и Корее,возможно, вариант подобный этому вирусу явился донором НА игенов казахстанского изолята 12. По гену НА изолят А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (12) отличался от утиного вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/201(Н 12) на один нуклеотид,что привело к замене кодируемой аминокислоты в положении 39 сна . В отличие от референсного штамма А/утка/Альберта/35/1976(11) исследуемый изолят обладает уникальными аминокислотными заменами Аа 5- , 44 и 99-. Штамм А/озерная чайка/Атырау/4378/10 (12) значительно отличался от вируса А/красноносый нырок/Балхаш/4523/2010. Если М-ген первого относился к чайковой линии, сформированной из вирусов преимущественно с подтипом НА Н 13, то второй принадлежал к европейской птичьей линии и к кластеру вирусов с НА , Н 8, 11,изолированных от диких уток в Корее и Южном Китае в 2003-2007 гг.(филограмма 2). Предлагаемый штамм имеет следующие свойства. Адаптационные свойства. Вирус А/озерная чайка/Атырау/4378/10(12) активно репродуцируются в системе куриных эмбрионов при оптимальной температуре (37 С) до инфекционного титра 5,75 ЭИД 50/0,2 мл, обладает высокой гемагглютинирующей иммуногенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280). Доступная длительность хранения при -20 С 2 года. Свойства агглютинации. Вирус обладает широким спектром агглютинации эритроцитов различных видов животных. Он одинаково активно агглютинирует эритроциты курицы, морской свинки, лошади, барана, кошки, крупного рогатого скота и человека 0 группы. Терморезистентностъ. Штамм обладает терморезистентным НА, более устойчивым к прогреванию при 560 С в течение 4 ч, чем прототипный вирус А/утка/Альберта /35/76 (11). Ингибиторочувствительностъ. Вирус проявляет ингибиторорезистентность к нативным и прогретым сывороткам крови курицы, морской свинки, крысы,кролика, барана и лошади. Адсорбционно-элюирующая активность. Штамм обладает хорошей адсорбирующей способностью по отношению к эритроцитам кур (90-95) полностью элюирует с них через 2 часа инкубации при 370 С. К штамму А/озерная чайка/Атырау/4378/10(12) получена кроличья иммунная сыворотка. Схема иммунизации. Для иммунизации использовали кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг. Первую иммунизацию проводили подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антиген (100 мкг) в смеси с полным адъювантом Фрейнда . Через 3 недели кроликов иммунизировали с адъювантом подкожно и без адъюванта внутривенно равным количеством антигена. Через 10 дней после второй иммунизации у животных брали кровь из краевой вены уха. Титр иммунной сыворотки к предлагаемому штамму в РТГА составляет 11280. Приготовленные на основе оригинального казахстанского штамма А/озерная чайка/Атырау/4378/2010 (12) диагностические препараты (антигены, иммунные сыворотки, тестсистемы) могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета у диких и домашних птиц. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/озерная чайка/Атырау/4378/10 в РТГА Иммунная сыворотка к референсному Гомологичный Титр антигемагглютининов к изоляту штамму титр А/озерная чайка/Атырау/4378/10 А///35/76 (11) 2560 1280 А///1/2009 (12) 2560 640 Примечания - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютининов Н 2-Н 16 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/озерная чайка/Атырау/4378/10 в РИНА Изолят 1 чайка/Атырау/4378/10 (12) Примечания - реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности вируса иммунной сывороткой ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа А/озерная чайка/Атырау/4378/10 микроорганизмов РГП на ПХВ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под номером М-2-13/Д,используемый для приготовления диагностических препаратов.