Штамм бактерий Bacillus thuringiensis k-Ym07/КОХ для получения биологического препарата против яблонной моли

(51) 12 1/20 (2012.01) 01 63/00 (2012.01) 12 15/20 (2012.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЯБЛОННОЙ МОЛИ-07/О для получения биопрепарата против яблонной моли. Предложенный штамм выделен из яблонной моли., найденном в Юговосточном Казахстане. Обладает высокой биологической активностью в отношении гусениц чешуекрылых насекомыхвредителей. При титре спор 1108 штамм -07/О на гусеницах яблонной моли, розанной листовертки и осинового зубчатого шелкопряда показал 95-100 смертность, а на гусеницах кольчатого шелкопряда смертность составила 90.(72) Сагитов Абай Оразулы Дуйсембеков Бахытжан Алишерович Исин Магжан Малгеждарович Слямова Назира Дусупкановна Адилханкызы Айнура Макаров Евгений Михайлович Исламова Рейхангуль Аблимитовна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт защиты карантина растений Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности, к получению средств защиты растений от насекомых представляющий собой новый штамм бактерий для получения вышеуказанного средства. Известен штамм бактерий-52 для получения биопрепарата против вредных насекомых (Каменек Л.К. Способ получения бактериального энтомопатогенного препарата. - Пат. России 2062577, 1996). Этот штамм имеет невысокое содержание эндотоксина(10-20) и мало приспособлен к условиям сухого континентального климата Казахстана. Известен типовой штамм. , входящий в состав препарата лепидоцида производства Бердского химзавода(Волкотруб Э.Н. и др. Новая препаративная форма лепидоцида // Экол. безопас. и беспестицид. технол. получ. растениевод, продукции. Матер. Всерос. Науч.-произв. Совещ. Краснодар, 24-26 авг. 1994. Ч. 2. Пушкино. С.204-205). Лепидоцид известен также под названиями Битиплекс (Дельта), Битобациллин,Гомелин, Бактоспеин, Новодор, , , др. Однако активность его недостаточно высока. Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего более высокой активностью в отношении насекомых, в частности, яблонной моли. Яблонная моль.,семейство горностаевые моли, является вредителем яблонной моли в промышленной зоне садоводства Казахстана, имеет повсеместное распространение и наносит существенный вред, развивается в 1 поколении. Географическое распространение Обитает в центральной части и на юге Западной Европы. В СССР исходный (анцестральный) ареал ограничен европейской частью моль интродуцирована в Закавказье, Казахстан, Среднюю Азию. Морфология и биология. Передние крылья белые с 12-16 черными точками, расположенными тремя неправильными рядами, на вершине крыльев имеются мелкие черные крапинки (размах крыльев 16-22 мм). Внешне похожа на имаго плодовой моли. . Яйцо желтоватое, сплюснутое,удлиненно-овальное. Гусеницы - возрастов светло-желтые с темной головой, переднегрудным щитком и грудными ногами гусеницывозраста желтые длина гусеницы последнего возраста 13-16 мм. Куколка вначале оранжево-желтая, позже зеленовато-желтая, голова темно-бурая. Коконы белые, плотные. Плодовитость бабочки - до 150 яиц. Самка откладывает яйца группами (по 15-60 шт.) черепицеобразно на ветки кормового растения вблизи почек и покрывает их щитком из застывшей слизи. Вначале щитки красноватой окраски, позднее буреют. Яйца развиваются 8-15 дней. Гусеницы,выйдя из-под щитка, проникают в набухшие почки,затем минируют вершинную часть листочков. После первой линьки (через 10-12 дней) они покидают мины и переходят к открытому образу жизни. Гусеницы плетут паутинные гнезда, скрепляя попарно листья питаясь, обгрызают листовую 2 пластинку или полностью объедают листья до основных жилок. С переходом на соседние ветки образуются колонии шелковинных гнезд,вмещающие до 200-300 гусениц. Длительность личиночной стадии составляет (с зимовкой) от 300 до 320 дней, а период активного развития весной 37-45 дней. Продолжительность развития куколки 815, иногда до 20 дней. Окукливаются в белых плотных, непрозрачных коконах, склеенных в компактные пачки, содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен коконов..( серотип) 07/ Казахского научно- исследовательского института защиты и карантина растений, Казахстан и Института систематики и экологии животных СО РАН, Россия. Выращивается на мясопептонном агаре (МПА),рыбном агаре при температуре 28 С, Селекция - по инсектицидной активности. Выделение - по А.Г. Кольчевскому и др. Выделение и отбор высокоактивных культурМетод. Пособие. Л. 1987, 21 с. Определение вида - по де Баржак и Фрахон (Н. .Е., , 1990, . 35, . 233). ЛК 50 - (инсектицидная активность, т.е. концентрация, вызывающая гибель на 3-и сутки 50 гусениц) Выделен из яблонной моли., найденном в Юго- восточном Казахстане. Время полного спорообразования - 5 суток. Возбудитель бактериоза яблонной моли имеет следующие характеристики Культурально-морфологические свойства кристаллообразующих изолятов. При росте на питательном агаре бактерии представляли -форму,колонии амебовидные, реже неправильной формы с волнистым краем, бежевые, матовые, прозрачные. Размер колонии 10 мм. Консистенция пастообразная(фиг.1). Микроскопический анализ. Штамм образует эллиптические споры и кристаллы ромбовидной формы размером (0,4-0,6)1,4 мкм (фиг.2) Биохимические свойства. Образует ацетилметилкарбинол, лецитоветеллиновая реакция положительна. Образует уреазу, гидролизирует крахмал. Гидролизует крахмал. Образует кислоту с салицином. Биологические свойства на лабораторных животных (патогенность). Принадлежит к 4-му классу опасности для теплокровных животных. Исследования о влиянии штамма бактерий на динамику численности гусениц яблонной моли проведены как в лабораторных, так и полевых условиях. При исследовании погибших от бактериоза гусениц яблонной моли были выделены. . Для определения численности бактерий в трупном материале проводят групповое взвешивание воздушно сухих гусениц. Выделение и отбор высоковирулентных культур.из( 7,2-7,5) и ЛАГ (глюкоза 0,7, пептон 0,7,дрожжевой экстракт 0,5,0,5, агара 1,5). Инкубируют культуры бактерий при 28 С в течение 5 суток. Тест-объектом служили гусеницы яблонной моли (.), розанной листовертки (.), кольчатого шелкопряда ( ) и осинового зубчатого шелкопряда соответственно возрастов. Гусениц скармливали листьями излюбленных деревьев,повторность четырехкратная, в каждой по 10 особей гусениц. Листья скармливаемых растений предварительно обрабатывали спорокристалической суспензией бактерий. В качестве контроля берется вариант с типовым штаммом -52 В.., имеющийся в коллекции культур Института. Опыт проводится в четырех повторностях при 20-25 С. ЛК 50 для штамма -07/ определяли также на гусеницах яблонной моли второго возраста. В качестве контроля использовали также штамм -52. Кормовым растением служили листья яблони. Суспензии биопрепаратов наносили на листья пульверизатором до появления стекающих капель, в контроле - водопроводной водой. Длительность опыта - 5 суток при температуре 27 С. Испытание штамма -07/ проведены в естественных условиях в яблоневом саду КазНИИЗиКР, а так же в осиннике ГЛПРорманы в Павлодарской области в период развития гусениц второго возраста первой генерации. Эталоном служил типовой шт. -52. Использовали одну концентрацию бактерий в четырех повторностях. Ветки деревьев с гнездами гусениц опрыскивали из пульверизатора с расходом суспензии по 15 мл на 10 см ветки. В контроле опрыскивание проводили водопроводной водой. Сравнительные данные энтомоцидной активности штаммас типовым штаммом -52 приведены в табл. 1 и 2. В таблице 1 показана активность спорокристаллических препаратов. Таблица 1 Активность спорокристаллических препаратов.для двух видов гусениц чешуекрылых Штамм Л 50, в скобках - доверительный интервал личинки чермуховой моли гусеницы яблонной моли 0,9 (от 0,82 до 1,06) 0,15 (0,12-0,17) 1,6(1,47-1,75) 0,27 (0,23-0,31) ЛК 50 (мг/мл) для чермуховой моли равна 0,9 мг/мл (от 0,82 до 1,06), для яблонной моли - 0,15 мг/мл (0,12-0,17). Активность типового штамма составляла соответственно 1,6 и 0,27 мг/мл. На гусеницах яблонной моли в условиях лабораторных опытов ЛК 50 культуры штамма -07/ и типового штамма составляла соответственно 3,2106 спор/мл суспензии. Результаты проведенных полевых испытаний штамма -07/ направленных на оценку биологической эффективности штаммов в отношении к гусеницам яблонной моли, розанной листовертки и осинового зубчатого шелкопряда при использовании титров спор 1108 показали высокую вирулентность - 95-100, тогда как активность типового штамма -52 варьировала от 58,0 до 62,0(таблица 2). Таблица 2 Биологическая активность штамма -07/ на гусеницахвозраста различных чешуекрылых в полевых условиях Штамм Общий процент гибели гусениц насекомых в среднем на 5 сутки яблонная моль розанная осиновый зубчатый листовертка шелкопряд 100 100 95,02,5 60,069, 9 58,065,4 62,072,5 0 0 0 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 07/КОХ,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК, под регистрационным номером В РКМ 0429, для получения биологического препарата против яблонной моли.