Штамм бактерий Bacillus thuringiensis (Drury) k-Ym07/KБ, для получения биологического препарата против яблонной моли

(51) 12 1/20 (2010.01) 12 15/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЯБЛОННОЙ МОЛИ(57) Штамм бактерий.-07/Б для получения биопрепарата против чешуекрылых насекомых. Предложенный штамм выделен из яблонной моли., найденном в Юго-восточном Казахстане. Обладает высокой биологической активностью в отношении гусениц чешуекрылых насекомыхвредителей. При титре спор 1108 штамм 07/Б на гусеницах яблонной моли, розанной листовертки и осинового зубчатого шелкопряда показал 100 смертность, а на гусеницах кольчатого шелкопряда смертность составила 95.(72) Сагитов Абай ОразулыДуйсембеков Бакытжан АлишеровичГлупов Виктор ВячеславовичХодырев Виктор Петрович Слямова Назира ДусупкановнаАдилханкызы Айнура(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт защиты и карантина растений(56) Волкотруб Э.Н. и др. Новая препаративная форма лепидоцида. Краснодар, 1994, с. 204-205 23768 Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности, к получению средств защиты растений от насекомых представляющий собой новый штамм бактерий для получения вышеуказанного средства. Известен штамм бактерий-52 для получения биопрепарата против вредных насекомых (Каменек Л.К. Способ получения бактериального энтомопатогенного препарата. - Пат. России 2062577, 1996). Этот штамм имеет невысокое содержание эндотоксина(10-20) и мало приспособлен к условиям сухого континентального климата Казахстана. Известен типовой штамм. , входящий в состав препарата лепидоцида производства Бердского химзавода(Волкотруб Э.Н. и др. Новая препаративная форма лепидоцида // Экол. безопас. и беспестицид, технол. получ. растениевод, продукции. Матер. Всерос. Науч.-произв. Совещ. Краснодар, 24-26 авг. 1994. Ч. 2. Пушкино. с.204-205). Лепидоцид известен также под названиями Битиплекс (Дельта), Битобациллин,Гомелин, Бактоспеин, Новодор, , , др. Однако активность его недостаточно высока. Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего более высокой активностью в отношении насекомых, в частности, яблонной моли. Яблонная моль.,семейство горностаевые моли, является вредителем яблонной моли в промышленной зоне садоводства Казахстана, имеет повсеместное распространение и наносит существенный вред, развивается в 1 поколении. Географическое распространение Обитает в центральной части и на юге Западной Европы. В СССР исходный (анцестральный) ареал ограничен европейской частью (на севере до Ленинградской обл.) моль интродуцирована в Закавказье,Казахстан, Среднюю Азию. Морфология и биология. Передние крылья белые с 12-16 черными точками, расположенными тремя неправильными рядами, на вершине крыльев имеются мелкие черные крапинки (размах крыльев 16-22 мм). Внешне похожа на имаго плодовой моли. . Яйцо желтоватое, сплюснутое,удлиненно-овальное. Гусеницы -возрастов светло-желтые с темными головой, переднегрудным щитком и грудными ногами гусеницывозраста желтые длина гусеницы последнего возраста 13-16 мм. Куколка вначале оранжево-желтая, позже зеленовато-желтая, голова темно-бурая. Коконы белые, плотные. Плодовитость бабочки - до 150 яиц. Самка откладывает яйца группами (по 15-60 шт.) черепицеобразно на ветки кормового растения вблизи почек и покрывает их щитком из застывшей слизи. Вначале щитки красноватой окраски, позднее буреют. Яйца развиваются 8-15 дней. Гусеницы,выйдя из-под щитка, проникают в набухшие почки,затем минируют вершинную часть листочков. После первой линьки (через 10-12 дней) они покидают мины и переходят к открытому образу жизни. Гусеницы плетут паутинные гнезда, скрепляя попарно листья питаясь, обгрызают листовую пластинку или полностью объедают листья до основных жилок. С переходом на соседние ветки образуются колонии шелковинных гнезд,вмещающие до 200-300 гусениц. Длительность личиночной стадии составляет (с зимовкой) от 300 до 320 дней, а период активного развития весной - 37-45 дней. Продолжительность развития куколки 8-15, иногда до 20 дней. Окукливаются в белых плотных, непрозрачных коконах,склеенных в компактные пачки,содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен коконов. Зимуют гусеницы 1 возраста под плотным, толстым щитком, в отличие от тонкого щитка плодовой моли. С наступлением мороза впадают в оцепенение..( серотип) 07/Б Казахского научно-исследовательского института защиты и карантина растений, Казахстан и Института систематики и экологии животных СО РАН, Россия. Выращивается на мясопептонном агаре (МПА),рыбном агаре при температуре 28 С, Селекция - по инсектицидной активности. Выделение - по А.Г. Кольчевскому и др. Выделение и отбор высокоактивных культурМетод. Пособие. Л. 1987,с. 21. Определение вида - по де Баржак и Фрахон (Н.Е., , 1990, . 35, . 233). ЛК 50 - (инсектицидная активность, т.е. концентрация, вызывающая гибель на 3-й сутки 50 гусениц) Выделен из яблонной моли., найденном в Юго-восточном Казахстане. Время полного спорообразования - 5 суток. Возбудитель бактериоза яблонной моли имеет следующие характеристики Культурально-морфологические свойства кристаллообразующих изолятов. При росте на питательном агаре бактерии представляли-форму,колонии амебовидные, реже неправильной формы с волнистым краем, бежевые, матовые, прозрачные. Размер колонии 10 мм. Консистенция пастообразная. Микроскопический анализ. Штамм образует эллиптические споры и кристаллы ромбовидной формы размером (0,4-0,6) х 1,4 мкм. Биохимические свойства. Образует ацетилметилкарбинол, лецитоветеллиновая реакция положительна. Образует уреазу, гидролизирует крахмал. Гидролизует крахмал. Образует кислоту с салицином. Биологические свойства на лабораторных животных (патогенность). Принадлежит к 4-му классу опасности для теплокровных животных. Исследования о влиянии штамма бактерий на динамику численности гусениц яблонной моли проведены как в лабораторных, так и полевых условиях. При исследовании погибших от бактериоза гусениц яблонной моли были выделены 2 23768. . Для определения численности бактерий в трупном материале проводят групповое взвешивание воздушно сухих гусениц. Выделение и отбор высоковирулентных культур.из насекомых осуществляли в чашках Петри с МПА(рН 7,2-7,5) и ЛАГ (глюкоза 0,7, пептон 0,7,дрожжевой экстракт 0,5,0,5, агара 1,5). Инкубируют культуры бактерий при 28 С в течение 5 суток. Тест-объектом служили гусеницы яблонной моли (.), розанной листовертки (.), кольчатого шелкопряда ( ) и осинового зубчатого шелкопряда соответственно возрастов. Гусениц скармливали листьями излюбленных деревьев,повторность четырехкратная, в каждой по 10 особей гусениц. Листья скармливаемых растений предварительно обрабатывали спорокристалической суспензией бактерий. В качестве контроля берется вариант с типовым штаммом -52 . ., имеющийся в коллекции культур Института. Опыт проводится в четырех повторностях при 20-25 С. ЛК 50 для штамма -07/Б определяли также на гусеницах яблонной моли второго возраста. В качестве контроля использовали также штамм -52. Кормовым растением служили листья яблони. Суспензии биопрепаратов наносили на листья пульверизатором до появления стекающих капель, в контроле - водопроводной водой. Корм после подсушивания помещали в чашки Петри с гусеницами, который через сутки заменяли на свежий (необработанный). Длительность опыта пять суток при температуре 27 С. Испытание штамма -07/Б проведены в естественных условиях в яблоневом саду КазНИИЗиКР, а так же в осиннике ГЛПР Ертс орманы в Павлодарской области в период развития гусениц второго возраста первой генерации. Эталоном служил типовой шт. -52. Использовали одну концентрацию бактерий в четырех повторностях. Ветки деревьев с гнездами гусениц опрыскивали из пульверизатора с расходом суспензии по 15 мл на 10 см ветки. В контроле опрыскивание проводили водопроводной водой. Энтомоцидная активность.( серотип) -07/Б. Сравнительные данные энтомоцидной активности штаммас типовым штаммом -52 приведены в табл. 1 и 2. В таблице 1 показана активность спорокристаллических препаратов Таблица 1 Активность спорокристаллических препаратов.для двух видов гусениц чешуекрылых Штамм ЛК 50, в скобках - доверительный интервал гусеницы яблонной моли личинки чермуховой моли-07/Б 0,94 (от 0,82 до 1,06) 0,15 (0,12-0,17) Типовой штамм 1,6 (1,47-1,75) 0,27 (0,23-0,31).ЛК 50 (мг/мл) для чермуховой моли равна 0,94 типового штамма составляла соответственно 3,2 х мг/мл (от 0,82 до 1,06), для боярышницы - 0,15 106 спор/мл суспензии. мг/мл (0,12 - 0,17). Активность типового штамма Результаты проведенных полевых испытаний составляла соответственно 1,6 и 0,27 мг/мл. Таким штамма -07/Б направленных на оценку образом, активность штамма -07/Б оказалась биологической эффективности штаммов в выше таковой типового штамма для личинок отношении к гусеницам яблонной моли, розанной черемуховой и яблонной моли соответственно в 1,7 листовертки и осинового зубчатого шелкопряда при и 1,8 раза. В то же время личинки черемуховой моли использовании титров спор 1108 показали значительно устойчивее гусениц яблонной моли. На высокую вирулентность - 100, тогда как гусеницах яблонной моли в условиях лабораторных активность типового штамма - 52 варьировала от опытов ЛК 50 культуры штамма -07/Б и 58,0 до 62,0 (таблица 2). Таблица 2 Биологическая активность штамма -07/Б на гусеницахвозраста различных чешуекрылых Штамм Общий процент гибели гусениц насекомых в среднем на 5 сутки яблонная моль розанная листовертка осиновый зубчатый 0 100 60,069,9 23768 В ходе эксперимента поставленных в лабораторных условиях оценивалась вирулентность штамма бактерий -07/Б на гусеницах различных видах чешуекрылых - возрастов при титрах спор 110 7 и 110 8 (таблица 3). Таблица 3 Биологическая эффективность штамма -07/Б на гусеницах различных видах чешуекрылых Штамм Общий процент гибели гусениц насекомых в среднем на 5 сутки яблонная моль кольчатый розанная шелкопряд листовертка Как видно из таблицы, при титре спор 1108 штамм -07/Б на гусеницах яблонной моли,розанной листовертки и осинового зубчатого шелкопряда показал 100-ую смертность, а на гусеницах кольчатого шелкопряда смертность составила 95. Высокая смертность насекомых происходила также с титром спор 1107, от 70,0 до 90,0. Смертность при заражении типовым штаммом была ниже от 1,5 до 1,7 раза соответственно. Таким образом, лабораторные и полевые испытания показали высокую активность штамма -07/Б. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерии.-07/Б, депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов, под номером 0253,для получения биологического препарата против яблонной моли.