Штамм бактерий Bacillus turingiensis (Drury), используемый для получения биологического препарата против чешуекрылых насекомых

(51) 12 1/20 (2011.01) 01 63/00 (2011.01) 12 1/07 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности,к получению средств защиты растений от насекомых,представляет собой новый штамм бактерий для получения вышеуказанного средства. Предложен штамм бактерий.( серотип) 2127-3 к, депонированный в Институте систематики и экологии животных СО РАН (Россия) для получения биологического препарата против чешуекрылых насекомых. Штамм в 2-4 раза более активен против чешуекрылых насекомых-вредителей сельского хозяйства, чем типовой штамм. .(72) Ходырев Виктор ПетровичГлупов Виктор ВячеславовичСагитов Абай Оразович Дуйсембеков Бахытжан АлишеровичМакаров Евгений МихайловичБаймагамбетов Едилбай ЖакеновичКопжасаров БакытИсин Магжан Малгеждарович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский институт защиты и карантина растенийИнститут систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности, к получению средств защиты растений от насекомых, и представляет собой новый штамм бактерий для получения вышеуказанного средства. Известен штамм бактерий-52 для получения биопрепарата против вредных насекомых (Каменек Л.К. Способ получения бактериального энтомопатогенного препарата. - Пат. России 2062577, 1996). Этот штамм имеет невысокое содержание эндотоксина(10-20) и мало приспособлен к условиям сухого континентального климата Казахстана. Известен типовой штамм., входящий в состав препарата лепидоцида производства Бердского химзавода (Волкотруб Э.Н. и др. Новая препаративная форма лепидоцида// Экол. безопас. и беспестицид, технол. получ. растениевод, продукции. Матер. Всерос. науч.произв. совещ. Краснодар, 24-26 авг. 1994. Ч. 2. Пушкино. .204-205). Лепидоцид известен также под названиями битиплекс (Дельта), битобациллин,гомелин, бактоспеин, новодор, , , др. Однако активность его недостаточно высока. Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего более высокой активностью в отношении насекомых, в частности, американской белой бабочки. Американская белая бабочка (АББ), семейство медведиц, является для Казахстана карантинным вредителем и обнаружена впервые в 2003 году в Алматинской области. В 2004-2005 гг в лесополосах на клене ясенелистом(.) обнаружены гнезда этого вредителя со 100-ной гибелью гусениц. Смертность насекомых отмечена во втором возрасте второй генерации. Септицемия насекомых вызывалась бактериями(3 ). Географическое распространение Северная Америка, центральная и южная Европа (Австрия,Болгария, Азербайджан, Украина, Краснодарский и Ставропольский края, Астраханская область,Казахстан. Биология. Самка откладывает в среднем до 600 яиц. Оптимальная температура для развития 2324 С, относительная влажность воздуха 75. После выхода из яйца гусеницы сразу приступают к питанию. В первом и во втором возрастах они объединяют несколько листьев,обвязанных паутиной. К концу пятого возраста гусениц гнездо может достигать 1-1,5 м. В этом возрасте гусеницы покидают гнездо и распространяются по всему дереву. Количество возрастов зависит от условий обитания и составляет 6-8. Зимует куколка в рыхлом сером коконе из волосков гусеницы в растительном мусоре на земле, в почве, под корой деревьев. Гусеницы летнего поколения окукливаются в кроне и растительных остатках. На юго-востоке Казахстана отмечается два поколения в году. Насекомое развивается в двух поколениях. Гусеницы выявляются преимущественно на клене,2 но могут поражать свыше 250 видов растений, в том числе шелковицу, яблоню, грушу. Морфология. Размах крыльев бабочки 20-36 мм. Крылья белые или белые с темными пятнами. Гусеницы первого возраста светло-желтые, длиной до 1,5 мм, взрослых - до 30-40 мм. Гусеницы старших возрастов густо покрыты щетинками и волосками с двумя рядами черных бородавок на спинной части и тремя рядами оранжево-желтых бородавок с боков. Куколка удлиненно-яйцевидной формы длиной до 15 мм. Яйцо шаровидное с плоским основанием размером 0,5-0,6 мм..( серотип). Штамм депонирован в коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН, Россия под номером 2127-3 к. Выращивают на мясопептонном агаре (МПА),рыбном агаре при температуре 28 С, Селекция - по инсектицидной активности. Выделение - по А.Г. Кольчевскому и др. Выделение и отбор высокоактивных культурМетод. Пособие. Л. 1987, с. 21. Определение вида - по де Баржак и Фрахон (.., ,1990, . 35, . 233). ЛК 50 - на среде ЛАГ (инсектицидная активность,т.е. концентрация, вызывающая гибель на 3-й сутки 50 гусениц) Выделен из американской белой бабочки, Южный Казахстан. Время полного спорообразования - 5 суток. Возбудитель бактериоза АББ - имеет следующие характеристики Кулътурально-морфологические свойства кристаллообразующих изолятов. При росте на МПА и среде ЛАГ бактерии представляли -форму (в рассевах белые колонии на МПА с зернистой или шероховатой поверхностью,с высоким формированием спор и кристаллов). На среде ЛАГ это крупные колонии с морщинистой поверхностью. В результате отбора клонов на среде ЛАГ получена культура штамма 2129-3 к практически с полным образованием клетками спор и параспоральных тел,при рассевах не образует колоний -вариантов (в рассевах на МПА серые колонии с гладкой поверхностью, полупрозрачные в проходящем свете, с преобладанием вегетативных клеток и полиморфных кристаллов). Микроскопический анализ. Штамм образует эллиптические споры и кристаллы бипирамидальной формы размером (0,4-0,6)1,4 мкм. Кроме того, продуцируются округлые и квадратные кристаллы меньших размеров (в среднем 0,3 мкм). Биохимические свойства. Образует ацетилметилкарбинол, лецитовителлиновая реакция положительна. Образует уреазу. Образует кислоту с салицином, не образует кислоты с сахарозой и маннозой. Разжижает желатин. Гидролизует эскулин. На бульоне не образует пленки. На желтковой среде не образует пигмента. По серологическим свойствам(реакция агглютинации с иммунной сывороткой для подвида Н 3) выделенные изоляты отнесены к. Структура белка дельта-эндотоксина (с помощью электрофореза методом - в геле по, , 1970,. 227, . 680). Выявлены две мажорные субъединицы - 130 и 68 кДа. Белковые профили штаммов практически полностью совпадают и по минорным компонентам. Исследования о влиянии штамма бактерий на динамику численности гусениц АББ проведены как в лабораторных, так и полевых условиях. При исследовании АББ выделяют гусеницы.из больных растений. Для определения численности бактерий в трупном материале проводят групповое взвешивание воздушно сухих гусениц. Выделение и отбор высоковирулентных культур(.) соответственно в четвертом и втором возрастах. Гусеницам боярышницы скармливали листья яблони Палласа(.), черемуховой моли - листья черемухи (.) по 15 особей гусениц или личинок. Листья скармливаемых растений предварительно обрабатывали смывами в одной из шести концентраций суспензий бактерий. В качестве контроля берется вариант с лепидоцидом. Опыт проводится в четырех повторностях при 20 С. ЛК 50 для штамма 2127-3 к определяли также на гусеницах АББ второго возраста. В качестве контроля служил лепидоцид. Кормовым растением служили листья клена. Суспензии биопрепаратов наносили на листья пульверизатором до появления стекающих капель, в контроле - водопроводной водой. Корм после подсушивания помещали в садки. Корм заменяли ежедневно на необработанный. Длительность опыта - трое суток при температуре 27 С. Испытание штамма 2127-3 к проведены в естественных условиях в лесополосе на клене близ реки Или в период развития гусениц второго возраста второй генерации. Эталоном служил лепидоцид. Использовали три концентрации бактерий в трех повторностях. Число гусениц в гнездах варьировало от 32 до 470. Ветки клена с гнездами гусениц опрыскивали из пульверизатора с расходом суспензии по 15 мл на 10 см ветки. В контроле опрыскивание проводили водопроводной водой. Энтомоцидная активность.( серотип) 2127-3 к. Сравнительные данные энтомоцидной активности штаммаи лепидоцида с известным штаммом приведены в табл. 1 и 2. В таблице 1 показана активность спорокристаллических препаратов Активность спорокристаллических препаратов.для двух видов личинок Штамм 2127-3 к Типовой штамм. ЛК 50, в скобках - доверительный интервал личинки черемуховой моли личинки боярышницы 0,94 (от 0,82 до 1,06) х 10-3 0,15 (от 0,12-0,17) х 10-3 1,6 (1,47 -1,75) х 10-3 0,27 (0,23-0,31) х 10-3 ЛК 50 для черешневой моли равна 0,94 х 10-3 или 0,94 (от 0,82 до 1,06) мг/мл, для боярышницы 0,15 (0,12-0,17) мг/мл. Активность штамма 2127-3 к оказалась выше таковой типового штамма для личинок черемуховой моли и боярышницы соответственно в 1,7 и 1,8 раза. В то же время личинки черемуховой моли значительно устойчивее гусениц боярышницы. На гусеницах АББ в условиях лабораторных опытов ЛК 50 штамма 2127-3 к и лепидоцида составляла соответственно 7,3105 спор/мл суспензии (с границами доверительного интервала 7,9 -6,7 105) и 2,8106 спор/мл (с границами доверительного интервала 4,0 - 3,4106). Изолят 2127-3 к оказался активнее типовой культуры в 3,8 раза. В полевых испытаниях в условиях юга Казахстана штамм 2127-3 к также продемонстрирована более высокая активность по отношению к АББ в сравнении с типовым штаммом(табл. 2). Результаты полевых испытаний штамма 2127-3 К в сравнении с типовым штаммом -52 приведены в таблице 2. Таблица 2 Биологическая эффективность штамма 2127-3 К и типовой культуры на гусеницах второго возраста американской белой бабочки (в скобках - смертность в ) Титр спор/мл 2,5 х 106 3 Число особей 3-х определений со штаммом -52 со штаммом 2127-3 к в начале погибших в начале погибших 312 89 (28,5) 340 280 (82,5) Число особей 3-х определений со штаммом -52 со штаммом 2127-3 к в начале погибших в начале погибших 285 198 (69,5) 470 470 (100) 370 370 (100) 232 232 (100) 420 0 (0) Как видно из таблицы, полная смертность гусениц при применении типового штамма -52 отмечалась лишь при титре 4107 спор/мл. В варианте с культурой штамма 2127-3 к стопроцентная смертность насекомых достигалась при титре спор 1107 спор (кристаллов)/мл. Таким образом, лабораторные и полевые испытания показали, что активность штамма 2127 г-3 к превышает таковую типового штамма для черемуховой моли и боярышницы примерно в 2 раза, а для АББ - в 4 раза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий.( серотип), депонированный в коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН, под номером 2127-3 к, используемый для получения биологического препарата против чешуекрылых насекомых.