Биологически активный препарат Иртаева и способ его получения

(51) 61 35/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2008/0129.1 08.02.2008 15.08.2012, бюл.820768, бюл.2, 16.02.2009 Иртаев Алманияз Сапаргалиевич 2335925 2, 27.10.20072006138867 , 10.05.20086210694 1, 03.04.20015587168 , 24.12.1996 27783 2, 16.10.2000(54) БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ ИРТАЕВА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ(57) Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к биологически-активным препаратам широкого спектра действия,предназначенных для лечения различных заболеваний, в том числе кожных (псориаза, язвы, экземы,дерматиты),ушибов,порезов,воспалительных заболеваниях суставов и других. Биологически активный препарат представляет собой конденсированный жидкий продукт горения древесины. Препарат используют в виде мази или 1 водно-спиртового раствора. Способ получения препарата заключается в свободном горении на воздухе предварительно высушенных древесных заготовок из деревьев или кустарников при температуре пламени 750 С. Одновременно осуществляют сбор жидких конденсированных продуктов горения под зоной горения древесины на воздухе. Горению подвергают около трети длины древесной заготовки. Древесными заготовками являются ветки деревьев или кустарников, предпочтительно, таволгоцвета Шренка с диаметром 5-10 мм и длиной около 100 мм. Изобретение относится к медицине, а именно к биологически-активному препарату широкого спектра действия, обладающему антисептической и антивирусной активностью, предназначенному для лечения кожных заболеваний (псориаза, язвы,экземы, дерматиты), ушибов, порезов, ожегов,воспалительных заболеваниях суставов и других, а также для применения в ветеринарии. Известен целый арсенал лекарственных средства на основе природного сырья, и он интенсивно пополняется. Так, известен линимент нефти нафталанана - сложная смесь углеводородов и смол. Применяет при заболеваниях кожи, воспалительных заболеваниях суставов, невралгиях, радикулитах. Известна серная мазь для лечения кожных заболеваний, содержащая серу и основу - вазелин.(Лекарственные средства,применяемые в медицинской практике в СССР, М., 1991, с.339). Однако использование продуктов переработки нефти в качестве основы ограничивает их применение из-за частой повышенной чувствительности кожи к ним. Разрабатываются модифицированные мази на основе серы, например,содержащая дополнительно эмульгатор, глицерин,лимонную кислоту, коричную кислоту.(А.с. СССР 198530 кл. 61 9/06, оп.1967.). Но они не устраняют недостатков серной мази, но снижают фармацевтическую активность. Известны лекарственные средства, содержащие ихтиол - смесь аммонийных солей сульфоновых кислот, т.е. содержащие органически связанную серу. Ихтиол получают при переработке горючих сланцев, их сухой перегонке. (Химический энциклопедический словарь М.,Советская энциклопедия, 1983 г.). Ихтиол и его смеси с различными наполнителями используют в медицинской и ветеринарной практике при лечении ожогов, рожистых заболеваниях, артритов, при невралгиях, воспалениях заболеваниях органов малого таза (справочник Лекарственные средства,применяемые в медицинской практике в СССР, М.,1991,с.143). Разрабатываются и новые ихтиолсодержащие препараты, в том числе и для ветеринарии. Например, описан карбахтиол, как комплексный миотонический препарат,с противовоспалительным и десенсибилизирующим свойствами,включающий ихтиол,фенол,наполнители и растворители, (Патент РФ 2251424, МПК(7) 61 35/04, 61 29/00 оп. 2005.05.10.) Однако препарат имеет противопоказания. Широкое распространение в медицине и ветеринарии получил деготь. Деготь получают при пиролизе бересты или другого сырья нагреванием без доступа воздуха. Например, линимент бальзамический (мазь Вишневского, справочник Лекарственные средства,применяемые в медицинской практике в СССР, М., 1991 г.) известен как антисептическое средство, при лечении ран,пролежней, язв и т.д. Известны многокомпонентные биологически активные мази, включающие деготь. Мазь Ям обладающая бактерицидно-акарициднофунгицидной активностью, содержит деготь, серу,2 лизол, скипидар, окись цинка, салициловую кислоту, вазелин. (А.с. СССР 178047, Кл. 61 9/06, оп. 1966). Модифицированная мазь Ям плюс,также обладающая бактерицидно-акарициднофунгицидной активностью,содержит дополнительно мумие и прополис. (Патент РК 7716,61 34/64, 61 17/00 оп. 2001.15.03) Эффективность мази показана на животных. Известен лекарственный препарат для лечения кожных заболеваний (Предварительный патент 16585 МПК 61 35/02, 61 35/04 оп. 2005.15.12.) состоящий из дегтя, бентонитовой глины и дистиллированной воды. Активность вышеуказанных препаратов определяется биологически активным компонентом - дегтем. Деготь содержит фенолы(фенол, крезолы,ксиленолы, гваякол и др.), насыщенные кислоты жирного ряда (от муравьиной до каприловой, а также высшие - пальмитиновую, арахиновую,бегеновую и др.), ненасыщенные кислоты жирного ряда, ароматические и смоляные кислоты(кетоны,альдегиды,спирты,углеводороды, углеводы и др.). Плотность дегтя 0,94-0,980 г/см(3), кислотное число 15-35 и до 45, содержание фенолов до 10 и до 15 (Химический энциклопедический словарь М.,Советская энциклопедия, 1983 г, с. 141). Деготь подразделяется на берестовый и березовый. Производство(дегтекурение) основано на пиролизе бересты или другого сырья нагреванием до 200-300 С в закрытых аппаратах без доступа воздуха. Кол-во и качество дегтя зависят от вида сырья и типа аппарата. Сырьем обычно служит чистая соковая береста, береста с валежника или сухостоя с примесью 20-30 луба, ошкуровочная береста с содержанием луба до 80, осиновая кора и др. Березовый деготь вырабатывают из т. наз. всплывных масел, образующихся в виде верхнего слоя при отстаивании пиролизата, получаемого при термической переработке не освобожденной от коры древесины. Масла перегоняют под вакуумом в специальных кубах с получением дегтя (до 70) и древесного пека. Деготь - маслянистая неклейкая жидкость, в тонком слое имеющая темно-бурую окраску, в отраженном свете - зеленоватую. Деготь и способ его получения являются наиболее близкими техническими решениями к заявляемым. Разработка новых лекарственных препаратов на основе природного сырья,обладающих биологически - активными свойствами для применения в медицинской и ветеринарной практике остается важной задачей, на решение которой направлено предполагаемое изобретение. Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента биологически активных препаратов широкого действия. Технический результат достигается биологически-активным препаратом представляющего собой смолистый конденсат продукта горения древесины. Препарат проявляет биологическую активность при лечении кожных заболеваний (псориаза, язвы, экземы, дерматиты),ушибов, порезов, воспалительных заболеваниях суставов, как антисептическое средство при инфекционных заболеваниях, для повышения иммунитета. Препарат получают при горении древесных заготовок плодовых деревьев -веток яблони, груши,облепихи, вишни, а также березы и др. Предпочтительным является использование веток таволгоцвета Шренка. Таволгоцвет- невысокий, до 3 метров высотой кустарник, произрастающий в южном Казахстане, центральной и западной части пустыни Бетпак-Дала, на хребтах Каратау,Боролдайтау и др. Предпочтение таволгоцвету основано на технико-экономических показателях процесса получения препарата. Наибольший выход его получен из веток таволгоцвета. Высушенные древесные заготовки диаметром 510 мм поджигают любым способом. Жидкие конденсирующиеся продукты горения собирают в емкость, размещенную под зоной горения дерева на расстоянии около 10 см от ветки. Собранная сконденсированная жидкость является заявляемым биологически активным препаратом. Он представляет собой маслянистую жидкость темного цвета со специфическим запахом. Препарат не растворим в воде, растворим в водноспиртовой смеси, диметилформамиде. ИК - спектр продукта указывает на его сложный состав, характеристические полосы пропускания имеют следующие значения волновых чисел (см -1) 3 3359,4 2942,9 1644,4 1454,3 1421,3 1331,7 1209,1 1042,5 885,6 698,3 624,8. С индексом вероятности от 46,8 до 51,64 полученные данные методом ИК-спектроскопии в диапозоне поиска 3295,26- 455,13 см(-1) свидетельствуют о наличии гидроксилсодержащих соединений относящихся к ряду фенолов,производных метопролола,криптенамина,фенолфталеинглюкороновой кислоты, диметокси-4-алкиламфетамина, глицерину. Исследования препарата показали, что его биологическую активность определяет сложная смесь фенолов и органических кислот и спиртов. Препарат не токсичен. Содержание в препарате токсичных элементов (мг/кг) не более свинец - 0,5 кадмий - 0,03 мышьяк - 0,05, ртуть - 0,01 пестицидов(мг/кг) не более Гексахлорциклогексан 0,1 ДДТ и его метаболиты 0,1 Гептахлор менее 0,002. Алдрин - менее 0,002. Радионуклиды (Бк/кг) не более цезий -137 стронций -90. Исследования 1 водно-спиртового раствора показали, что препарат содержит следующие металлы (мг/л) Железо -2,9 Медь - 0,33 Цинк- 1,0 Магний- 43,9 Никель - 0,067. Исследования раствора препарата с помощью аминокислотном анализаторе позволили определить в нем следующие соединения Аспаргиновая кислота, сирин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, изолейцин, лейцин,тирозин, фенилаланин, гистидин, лизин. Биологическая активность препарата опредяли испытаниями мутагенной,антимутагенной,комутагенной, антибактериальной и антивирусной активности препарата. Испытания данного препарата на мутагенную,антимутагенную и комутагенную активности проводили согласно метода Эймса/. , 1975,31.347364). Для определения мутагенного эффекта в работе использовались индикаторные штаммы микроорганизмовТА 100( 46/ ,В,101) и ТА 98 (3052/, ,101), предоставленные доктором В.(лаборатория биохимия, Калифорнийский Университет, Беркли). Мутагенная и комутагенная активности у испытуемого препарата не выявлена. Препарат обладает слабой антимутагенной активностью. Антибактериальная активность данного препарата по отношению ко всем использованным тест-организмам - очень высокая. Определены концентрации препарата (12500),которые не оказывают видимого цитотоксического действия на культуру клеток куриных фибробластов. По результатам определения антивирусной активности препарата, можно сделать заключение,что в разведении 140 он обладает выраженным вирулицидным (при действии на внеклеточный вирус) и минимально активным антивирусным действием при действии на реплицирующийся вирус в разведении 1640. Способ получения препарата заключается в термической обработке древесины путем ее свободного горения. Горению подвергают древесные заготовки, обычно в виде веток деревьев или кустарников, предпочтительно, таволгоцвета Шренка. Заготовки имеют диаметр 5-10 мм и длину около 300 мм. Ветки высушивают при комнатной температуре и затем прогревают до 300 С. Поджигают древесные заготовки любым способом. Температура пламени составляет около 750 С. Горение - бездымное, сопровождается синим свечением. Одновременно осуществляют сбор жидких конденсированных продуктов горения под зоной горения древесины на воздухе. Горению подвергают около трети длины древесной заготовки,около 100 мм. В процессе горения жидкие продукты горения, конденсируются и самопроизвольно стекают в емкость, которую устанавливают под зоной горения на расстоянии около 10 см от ветки. При необходимости, препарат очищают от шлака центрифугированием. Выход препарата составляет около 2 мас Препарат используют в виде мази или 13-14 водно-спиртового раствора. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения Сведения,подтверждающие возможность осуществления способа получения препарата. Пример 1. Из веток таволгоцвета Шренка делают заготовки длиной 300 мм, диаметром 0,5 мм. Ветки просушивают на воздухе в течение 3 дней, затем прогревают в сушильном шкафу до 300 С. Заготовку поджигают с помощью спички. Горение осуществляют на длину 100 мм. Под горящей заготовкой на расстоянии 100 мм устанавливают металлическую емкость. Продукты горения,конденсируясь на воздухе, стекают емкость. Выход препарата составил 2 мас Пример 2. Наличие мутагенного эффекта регистрировали путем учета обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Штамм ТА 100 фиксирует мутации замены пар оснований, штаммТА 98 позволяет обнаруживать мутагенный эффект химических соединений,действующих по типу сдвига рамки считывания. Испытания проводили полуколичественным методом учета генных мутаций без метаболической активации, позволяющим обнаруживать мутагены прямого действия. Получение бактериальной суспензии. Ночную культуру клеток подращивали в бульоне Хоттингера при 37 С в течение 3 часов. Дважды осаждали центрифугированием и ресуспендировали в соленом концентрате доводя до плотности 2-310 клеток в мл. Для определения мутагенного, антимутагенного и комутагенного эффекта исходную суспензию культуры через столбики(0,6 верхний полуобогащенный агар) высевали на чашки Петри с 1,5 агаром, обогащенным 0,05 мМ раствором гистидина, и после 48 часов инкубации проводили подсчет -ревертантов (обратных мутантов). Степень мутагенного эффекта определяли кратностью превышения числа ревертантов в опытах над контролем. Препарат для исследований растворяли в растворителе-диметилсульфоксиде(ДМСО) в соотношениях 110 150 1100. В качестве позитивных контролей в работе использовали стандартные мутагены прямого действия- нитрозометилмочевина (НММ) вызывает мутации замены пар оснований (100 мкг/ч), 2,7-диамино-4,9-диокси-4,5,9 Д 0-тетрагидро 5,9-диазопирен (ДДТДП) - индуцирующий мутации по типу сдвига рамки считывания (250 мкг/ч). Негативным контролем служили инкубационные смеси с растворителем. Результаты экспериментальных исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 Мутагенная активность препарата Концентрация испытуемого препарата 110 150 1100 Негативный контроль Позитивный контроль НММ ДДТДП Как видно из табл.1, тестируемый препарат не обладает мутагенной активностью, так как он не индуцирует увеличения уровня мутаций по сравнению с негативный контролем ни при одной из испытанных доз. Многие вещества при комбинированном действии с мутагенами различной природы могут давать разнообразные модификационные эффекты,увеличивая или уменьшая мутационный уровень. В связи с этим в задачи исследования входило изучение комутагенного и антимутагенного действия данного препарата Таблица 2 Комутагенная и антимутагенная активности препарата Препарат Количество ревертантов на чашку ТА 100 ТА 98 904 1054(1100)мутаген 1121 НММ 1288 ДДДТП Полученные результаты свидетельствуют о том, активность,что препарат проявляет слабую антимутагенную 4 снижение (1,2-1,5 раз) количества-ревертантов на штаммах 00 и ТА 98. Пример 3. Испытания антибактериальной активности. Для испытания антибактериальной активности исследуемого препарата применяли метод диффузии в агар (Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках). Данный препарат в концентрации 100 и 50 (растворенный в ДМСО), вносили в лунки на поверхности агаризованной органической среды, предварительно засеянной соответствующим тест-организмом. Результаты учитывали по наличию и величине зоны угнетения роста чувствительных клеток после инкубации в течение 24 часов при 37 С. В качестве тест-организмов использовали условно-патогенные и патогенные бактерии, вызывающие заболевания человека,животных и растений. Данные представлены в таблице 3. Таблица 3 Антибактериальная активность испытуемого препарата 7 Диаметр зоны угнетения роста микроорганизмов в мм Растворитель (ДМСО) Препарат (50) Препарат (100) 0 30 25 0 43 35 0 35 30 0 39 33 0 29 32 0 39 32 0 45 37 0 36 31 Данные таблицы 3 показывают, что препарат обладает высокой антибактериальной активностью по отношению ко всем использованным тесторганизмам.. Пример 4. Испытание на антивирусную активность. Определение антивирусной активности препарата проводили согласно Методическим указаниям МЗ СССР (1977 г.) на культуре клеток куриных фибробластов (КФ), зараженных вирусом гриппа А/ВТТЧ (вирус чумы птиц, штамм Вейбридж). Предварительно определяли токсичность испытуемого соединения для 48-часовой культуры незаряженных клеток. В этих целях препарат в разведении 110. 120, 140, 180, 1160,1320, 1640, 11280, 1 2560 15120 вносили в питательную среду и инкубировали клетки при 37 С в течение 24-48 час. На каждую концентрацию препарата использовали не менее 3 флаконов. Степень токсического действия препарата в культуре клеток оценивали по четырехкрестовой системе. Контролем служили интактные клетки такого же срока культивирования. Таблица 4 Токсичность препарата для культуры куриных фибробластов- разведения препарата готовили в среде культивирования Из данных таблицы следует, что в испытанных концентрациях препарат обладает выраженным токсическим действием для культуры клеток КФ. При использовании его в разведении 1160 уровень токсичности достигал 100, при разведении 1320 степень токсичности достигает 58,при разведениях 11280 уровень токсичности сопоставим с контролем. Изучение влияния препарата на репродукцию вируса в культуре клеток проводили двумя способами 5 а) обрабатывали вирусную суспензию (вирус гриппа, А/ВГГЧ,ЭИД 508,0 512 ГАЕ/мл) препаратом в разведении 120, 140, 180, 1160,1320, 13200 в течение 30-60 минут при 37 С с целью выявления непосредственного инактивирующего (вирулицидного) действия испытуемого соединения на внеклеточный вирус б) вносили препарат в состав агарового покрытия,в этом случае использовали концентрации, составляющие половину от первой концентрации препарата, не вызывавшей видимых(минимальная половинная концентрация - МПК 12560). Для определения антивирусной активности монослой клеток заражали по общепринятой методике (метод бляшек под агаровым покрытием) Множественность заражения вирусом 0,01 БОЕ/клетка (бляшкообразующих единиц). Через 48 часов определяли величину инфекционного титра вируса в опытных и контрольных пробах путем подсчета негативных колоний под агаровым покрытием (окраска нейтральрот). Результаты представлены в таблицах 5 и 6. Таблица 5 Вирулицидная активность препарата в культуре КФ, зараженной вирусом А/ВПЧ Разведение препарата(среднеарифметическое из размножения вируса,показаний 3-х опытов) 120. 4,3 3,6 140. 4,8 3 1320. 5,9 2 11280. 7,8 од 13200. 7,8 ОД 0 (контроль) 7,9 вирус обработан препаратом в указанных концентрациях в течение 30 мин при 37 С Из данных таблицы следует, что испытуемый препарат обладает выраженным вирулицидным действием. Степень ингибирования или индекс эффективности (ИЭ) при разведениях 120-140 составляет 3,0-3,6 . Результаты определения антивирусной активности препарата, определенной в присутствии его в составе агарового покрытия, представлены в таблице 6. Таблица 6 Влияние препарата на репродукцию вируса гриппа А/ВПЧ в культуре КФ Разведение препарата 1640. 4,75 11280. 53 0 (контроль) 6,83 препарат вносили в состав агарового покрытия Как видно из данных таблицы в испытуемых концентрациях препарат оказывает антивирусное действие (1,5-2,0 ). Сведения,подтверждающие возможность осуществления применения препарата. Пример 5. Препарат в количестве 13 г растворяют в 100 мл 40 водном растворе этилового спирта. Полученный раствор использовали для смазывания ссадин, кровотечений и везикул различной этиологии у детей от 6 месяцев до 3-х лет. Пример 6. У больной М. (2 года) в результате травмы ноги произошло наружное кровотечение раны размером 15 мм. Препаратом, приготовленный согласно примеру 5 смазывают дважды в день наружное кровотечение Эпителизация раны наступила на 2-й день. Пример 7. У больной А. (3 года) обнаружены везикулы. Препаратом, приготовленным согласно примеру 2, везикулы смазывают трижды в день. За три дня везикулы лопнули и подсохли. Пример 8. Больная В. страдает псориазом. Препарат, приготовленный согласно примеру 1,наносили на пораженное место стеклянной 6 Степень ингибирования размножения вируса,2,08 1,5 палочкой. 15-20 минут препарат выдерживают на воздухе. Процедуру повторяют в течении 2-5 дней. После 3-х дней лечения наблюдается видимое улучшение состояния больного. Пример 9. Больной Д. страдает болями в суставах. 1 водно-спиртовым раствором препарата растирали суставы трижды в день. Лечение осуществляли 10-20 дней. Пример 10. Собака с дерматитом на коже подвергалась обработке 1 водно-спиртовым раствором. Пораженные участки обрабатывали 2 раза в день. Заживление наблюдали на 5-7 день. При применении дополнительно компресса с раствором на больной участок со временем экспозиции - 2-3 часа выздоровление наступало через 3-5 дней. Пример 11. Кошку с экземой на коже лечили,согласно примеру 8. Лечение с видимым улучшением продолжалось в течении 10-14 дней. Приведенные сведения свидетельствуют о широком спектре применения биологически активного препарата, полученного в режиме свободного горения древесных заготовок. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологически активный препарат на основе продукта термической обработки древесины,отличающийся тем, что является конденсатом продукта горения древесины. 2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что обладает антибактериальной активностью. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что обладает активностью при лечении кожных заболеваний - псориаза, язвы, экземы, дерматитов. 4. Препарат по п.1, отличающийся тем, что обладает антивирусной активностью. 5. Препарат по п.1, отличающийся тем, что обладает ранозаживляющим действием,активностью при лечении ушибов и порезов. 6. Препарат по п.1, отличающийся тем, что обладает активностью при лечении воспалительных заболеваниях суставов. 7. Способ получения биологически активного препарата термической обработкой древесины,отличающийся тем, что термическую обработку осуществляют путем свободного горения на воздухе предварительно высушенных древесных заготовок из деревьев или кустарников при температуре пламени 750 С с одновременным сбором жидких конденсированных продуктов горения. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что древесными заготовками являются ветки деревьев и кустарников диаметром 5-10 мм и длиной около 100 мм. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что горению подвергают около трети длины древесной заготовки. 10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что сбор жидких конденсированных продуктов горения осуществляют под зоной горения древесины.