Штамм микроорганизмов Azotobacter vinelandii SA2 для производства удобрения

(51) 12 1 /20 (2006.01) 01 63/00 (2006.01) 12 1/065 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Для улучшения азотного питания растений недостаточно вводить в почву соединения азота. Необходимо повысить эффективность потребления азота растением. Для этого давно применяют взаимодействие микроорганизма, производящего азот в форме, приемлемой для растений, и клеток корней растений. Задачей заявляемого изобретения является создание удобрения обладающее, азотфиксирующей и фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевание пшеницы, на основе штамма 2. Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре 4-6 С. Штамм 2, депонирован в ТОО КазНИИППП под номером В - 344. Свидетельство о депонировании от 04.02.2013 года Депозитария ТОО Казахского научноисследовательского института перерабатывающей и пищевой промышленности 050060, г. Алматы, пр. Гагарина, 238 Г.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Сураганова Динара Аскаровна Есенбаева Акмарал Ертугановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Изобретение относится к биотехнологии,сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм несимбиотических азотфиксирующих бактерий 2 из каштановой почвы Северного Казахстана. Изобретение относится к биотехнологии,сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм несимбиотических азотфиксирующих бактерийА 2 из каштановой почвы Северного Казахстана. Бактерии рода являются эффективными стимуляторами разных видов растений (И.А. Дегтярева и др., 2001..,1994 Антипчук А.Ф. и др., 1985), что объясняется их способностью фиксировать молекулярный азот синтезировать гормоны роста и витамины (Олюнина Л и др., 1999. .., 1986.., 1970) способностью некоторых штаммов азотобактера мобилизовывать труднорастворимые соединения фосфора, улучшая фосфорное питание растений ( .., 2000.., 2000 Баженов Д.П. и Чернышев .Л, 1999), а также ослаблять действие на прорастающие семена неблагоприятных факторов (Лихолат Т.В. и Шишова Т.К., 2000). Использование биоудобрений на основе азотобактера способствует увеличению количества и улучшению качества урожая способны колонизировать ризосферу различных растений(Мальцева Н.Н. и др., 1992), а также стимулировать деятельность аборигенной микрофлоры (Пат. 2177466, РФ). Биологические препараты на основе азотобактера позволяют значительно снизить расход азотных удобрений ( М.., 1997). Поэтому поиск новых штаммов азотфиксирующих бактерий,проявляющих антагонистическую активность по отношению к грибным фитопатогенам, обладающих комплексом свойств благоприятно воздействующих на растения, и перспективных с точки зрения создания биопрепаратов является актуальной задачей биотехнологии. Известен штаммВ 3173,предназначенный для получения бактериального удобрения /А.с. СССР 1359272, кл. С 05 11/08, 1985/, повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам. Известен штамм 92 /А.с. СССР 9221105, кл. С 05 11/08, 1982/, обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность. Наиболее близким к заявляемому является штаммИБ 4, подавляющий развитие заболеваний растений, вызываемых корневыми гнилями, и стимулирующий рост растений за счет продуцирования гормонов роста цитокининов в культуральной жидкости. Недостатком данного метода является невысокий спектр антагонистического действия и сравнительно не высокая продуктивность /Патент 2245918 С 1,10.02.2005/. Задачей заявляемого изобретения является выделение нового природного штамма 2 2 с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний сельскохозяйственных культур, обладающего высокими продуктивностью и способностью повышать урожайность и качество зерна. Местный штамм 2 выделен в естественных условиях из каштановой почвы Северного Казахстана. Идентификацию штамма проводили по методике, приведенной в книге Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж. Хоулта. Штамм хранится и поддерживается в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности под номером В-344. Штамм 2 имеет следующие характеристики 1. Культурально-морфологические- мелкие овальные палочки (1,5-2,0 мкм)- подвижные за счет перетрихиальных жгутиков или неподвижные- эндоспор не образуют. Хорошо растут на безазотистой среде Эшби с сахарозой, маннитом или глюкозой в качестве источника углерода, среде Чапека. Культура быстрорастущая, через 24 часа при температуре- характер контура края - расплывчатый- растет при температуре (281) С- растет на агаризованной среде Берка- растет на жидкой среде Федорова с мелассой- растет на безазотистой среде Эшби- растет на безазотистой среде Эшби, с сахарозой- растет на безазотистой среде Эшби, с маннитом- растет на безазотистой среде Эшби, с глюкозой- растет на среде Чапека. Оптимальной температурой роста штамма 2 является 26-30 С. Пределыдля его роста 6,8-7,2. Штамм может храниться без потери полезных свойств при температуре 4-6 С (в холодильнике) на косяках с агаризованной средой Эшби. Способ, условия и состав сред для размножения штамма Среда Эшби - 0,02 2 НР 4, 0,02 4, 0,02 , 0,01 24, 0,5 СаСО 3, 2 маннит, 2 агар, вода водопроводная - 1 л.- 20,0 вода водопроводная - 1 л. По истечении 4-х суток с помощью светового микроскопа осуществляли подсчет клеток в камере Горяева определяли титр, который который составил 9,6-1010 КОЕ/мл. Пример 1 Для сравнения продуктивности нового штамма 2 с известным штаммомИБ-1 проводили выращивание в колбах на шейкереинкубаторе при 180-200 об/мин в течении 60 часов, при температуре 28 С на жидкой питательной среде следующего состава,сахароза 3,0 2 НРО 4 0,03 СаНР 4 0,020,05 СаСО 3 0,5 24 0,02. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о более высокой продуктивности предлагаемого штамма над штаммом по прототипу. Таблица 1 Продуктивность штаммаА 2 Выращивание штаммов 2 проводили в качалочных колбах на качалке при 180-200 об/мин в течении 60 часов, при температуре 28 С на жидкой питательной среде следующего состава,сахароза 3,0 2 НРО 4 0,03 СаНР 4 0,020,05 СаСО 3 0,5 24 0,02. Определяли титр полученной биомассы 2,который составил 1,51011 КОЕ/г (таблица 1). У выделенного штамма 2 определена азотфиксирующая активность(356,5 нМ 2/млч). Выделенный штамм может быть отнесен к высокоактивным, так как величина ацетиленредукции у него выше 150 нМ 2/млч 1. Для инокуляции использовали 4-суточную культуру, выращенную на жидкой среде Эшби Пример 2 На чашки Петри с агаризованной средой КГА(картофель тертый - 200 г глюкоза - 20 г агар - 15 г вода водопроводная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма 2. Чашки инкубируют при 28 С в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.3 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма. Таблица 2 Антагонистическое действие штаммов 2 и штамма по прототипу на тест-культуры фитопатогенных грибовп/п Пример 3 Семена различных сельскохозяйственных культур стерилизовали последовательным погружением в 70 спирт (2 мин), 33 перекись водорода (1 мин), 70 спирт (1 мин), после этого промывали в стерильной воде. Стерильным пинцетом семена выкладывали на поверхность свежеразлитого остывшего голодного агара в чашке Петри, 10-12 семян на 1 чашку. Чашки Петри с семенами помещали в темное место для проращивания на 2-3 суток. После образования корешка длиной 0,5-0,7 см семена переносили в пробирки с 10 мл питательной среды для растений(по 1 семени в пробирку). Готовили смыв биомассы микроорганизмов 2 с поверхности скошеной Диаметр зоны подавления роста гриба, мм Штаммы 2 ИБ 4(по прототипу) 19 20 16 14 17 12 18 20 16 14 20 19 питетельной среды и полученной суспензией инокулировали семена растений в пробирках. Для инокуляции использовали семена злаковых пшеницы, рожь, просо и кормовых кукурузу. Для проверки активности штамма использовали контрольные семена. Культивирование проводили при комнатной температуре, с продолжительностью светового дня 16 часов, в течение 21 суток. При изучении влияния суспензии 2 на развитие проростков тестовых культур, их длину и биомассу, установлено его ростстимулирующее действие. Получено значительное увеличение длины корешков (от 20 до 80 на 10 сутки), что очень важно, так как корни обеспечивают растение различными питательными элементами, в том числе минеральными (табл. 1-2). 3 Таблица 1 Влияние 2 на длину корешков различных сельскохозяйственных культур Культура Пшеница Рожь Просо Кукуруза Таблица 2 Влияние 2 на биомассу корешков различных сельскохозяйственных культур Культура Пшеница Рожь Просо Кукуруза Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать для предпосевной обработки семян зерновых и кормовых культур штамм 2, обладающий полифункциональным положительным действием на растения. Новый выделенный штамм 2 отличается высокой продуктивностью, широким спектром антагонистического воздействия на грибные фитопатогены и ростстимулирующей активностью за счет способности продуцирования цитотокининов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизмов 2, депонирован в депозитарии ТОО Казахский научно исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности под номером В-344, используемый для получения азотфиксирующего удобрения для зерновых и кормовых культур.