Штамм Azotobacter chroococcum Az-3, повышающий продуктивность пшеницы и обогащающий почву азотом

(51) 12 1/00 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ создании биопрепарата для повышения урожайности пшеницы и содержания азота в почве. Штамм-3, выделен из ризосферы пшеницы сорта Акмола 2 на южных карбонатных черноземах. Предложен штамм-3,обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей корневой гнили пшеницы и азотфиксирующей активностью в почве с целью получения биопрепаратов для повышения урожайности зерна. При внесении азотобактера штамм -3 содержание нитратного азота повышается на 0609 мг/кг почвы и прибавка к урожайности пшеницы составляет - 12,6. Штамм депонирован в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под регистрационным номером 161 (19 ноября 2008 г.).(72) Науанова Айнаш Пахуашовна Чуркина Галина Николаевна Ишмуханбетова Гульзира Нурмаханбетовна Айдаркулова Рая Садуахасовна Назарова Айман Жадгеровна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина-3, ПОВЫШАЮЩИЙ ПРОДУКТИВНОСТЬ ПШЕНИЦЫ И ОБОГАЩАЮЩИЙ ПОЧВУ АЗОТОМ-3, который может быть использован при Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штамма-3, который может быть использован при создании биопрепарата для повышения урожайности пшеницы и содержания азота в почве. Интенсификация сельскохозяйственного производства за последние полвека, базирующаяся на применении высоких норм минеральных удобрений, привела к истощению естественного потенциала и плодородия почв, ухудшило качество воды, воздуха и сельскохозяйственной продукции. Поэтому на смену интенсивному землепользованию приходит экологически сбалансированное землепользование, основанное на применении биологических препаратов. В настоящее время весьма актуальна проблема получения принципиально новых препаративных форм,способных обеспечивать как защиту растений от возбудителей болезней, так и комплексное минеральное питание микробных клеток и растительного организма. Одним из таких биопрепаратов является азотобактерин,изготовленный на основе активных штаммов азотфиксирующих микроорганизмов,обеспечивающий азотфиксацию, контроль развития патогенов,продуцирование физиологически активных веществ. Известен штаммВ 3173,предназначенный для получения бактериального удобрения А.с. СССР 1359272, кл. С 05 11/08, 1985, повышающий урожайность злаковых культур. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам. Наиболее близким к заявляемому является штамм 92 А.с. СССР 922105, кл. С 05 11/08, 1982., обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность. Известен штамм бактерий,для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами,и повышения урожая. Однако ростстимулирующие свойства этого штамма изучено, отсутствуют результаты исследований в полевых условиях,поэтому трудно судить о повышении урожайности в естественно-полевых условиях А.с. РФ 2224791 12 1/20, 2004. Технической задачей изобретения является получение нового штамма, обеспечивающего при внесении в почву инокулята повышение урожая зерна пшеницы, путем снижения распространения корневой гнили в посевах ячменя и повышения содержание азота в почве. Предложен штамм-3,обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей корневой гнили пшеницы и азотфиксирующей активностью в почве с целью получения биопрепаратов для повышения урожайности зерна. Штамм-3, выделен из ризосферы пшеницы сорта Акмола 2 на южных карбонатных черноземах. 2 Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов МОН Республики Казахстан под регистрационным номером 0239 (15.11.2008 г.) и предназначен для получения биопрепарата азотобактерина используемый в технологиях выращивания зерновых культур. В сравнении с известными штаммами имеет следующую характеристику Морфологические и культуральные признаки. На среде Эшби в молодом состоянии клетки имеют вид короткой палочки с закругленными концами размером 2-34-6 мкм. Позже палочки становятся округлопродолговатыми,затем шаровидными,располагаются поодиночке, парами, короткой цепочкой, иногда пакетами. В зрелом состоянии клетки имеют округлую форму, окруженную слизью, которая с течением времени уплотняется и превращается в капсулу. Структура мелкозернистая,слизистая по консистенции. Колонии округлые, выпуклые,непрозрачные, приподнятые, легко снимаются с агара, цвет грязно-белый, обычно диаметром 1,02,0 мм через 5-6 суток инкубации на среде Эшби. Физиологические свойства. Штамм является мезофилом, оптимальный интервал температур составлет 23-32 С. Для штамма-3 оптимальная кислотность среды находится на уровне рН 6,8-7,0. По результатам исследования для роста штамма-3 наиболее благоприятным источником азота является нитрат калия. Диаметр колоний-3 на средах Эшби с различными источниками азота на 7 сутки находился в пределах 1,-2,0 мм. Из источников углерода усваивает мальтозу, маннит,крахмал, глюкозу, сахарозу, где на седьмой день культивирования диаметр колонии достигал 1,75-3,5 мм. Умеренный рост у штамма наблюдался на средах с лактозой и этиловым спиртом. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма Хранение на коротко скошенном агаре под вазелиновым маслом при температуре 3-5 С в течение 3 месяцев. Среда Эшби маннит-20 г К 2 НРО 4-0,2 г О 472 О - 0,2 г- 0,2 г 2 О 4 - 0,1 г СаСО 3 - 5 г агар-20 г 1 л воды водопроводной, рН-7-7,2. Стерилизация 120 С,20 минут. Пересев 1 р/3 месяца при температуре 27 С, 6-7 суток. Лиофильное хранение при температуре не выше 0 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Путем пересева культуры на агаризованную среду Эшби, при температуре 25-28 С время культивирования 5-7 суток, затем пересевают на скошенный агар. Условия и состав среды для ферментации. Состав ферментационной среды маннит-20 г К 2 НРО 4-0,2 г О 472 О - 0,2 г- 0,2 г 2 О 4- 0,1 г СаСО 3 - 5 г 1 л воды водопроводной. Объем среды 100 мл в качалочной колбе на 300 мл. Стерилизация 120 С-20 мин. Время культивирования 40-48 часов , 220 об/мин. Пример 1. Антагонистическая активность азотобактера по отношению к фитопатогенным грибам, возбудителям корневой гнили зерновых культур Продуцирование антибиотических веществ бактериями является одним из основных факторов воздействия на фитопатогенные микроорганизмы,который практически выпал из поля зрения исследователей антагонизма азотобактера. Большинство авторов сообщает о способности штаммовпродуцировать антифунгальные антибиотики, но в литературе практически нет сведения о химической природе этих веществ. В единственном источнике сообщается об антифунгальном антибиотике,продуцируемым штаммом 92, по химической структуре, представляющий собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты. Антибиотик угнетал рост фитопатогенных грибов,, ,,Придачина , Новогрудская Е.Д., Кругляк Е.Б.- продуцент нового противогрибного противогрибкового антибиотика // Антибиотики. -1982. Т. 27, 1. с.3-5 Задачей наших исследований было изучение антифунгальной активности азотфиксирующих бактерий родапо отношению к возбудителям фузариозно-гельминтоспориозной инфекции зерновых культур. Наличие антагонизма азотобактера в отношении фитопатогенных грибов определяли методом совместного выращивания бактерий и фитопатогенов в чашках Петри на картофельно-глюкозном агаре, поскольку данная среда подходит для создания оптимальных условий для одновременного роста культур гриба и бактерий рода . Суспензию спор тест-гриба высевали на агаризованную среду, а исследуемую культуру вносили поверх, делая посев уколом. Чашки инкубировали в термостате в течение 3 сут,при температуре 28 С. Антагонизм выявляли визуально по наличию вокруг колонии бактерии зоны подавления роста тест-гриба Четвериков С.П.,Логинов О.Н. Новые метаболиты, обладающие антигрибной активностью // Микробиология. -2009. Т.78, 4.с.479-483 При определении спектра антагонистической активности азотобактера было обнаружено, что изучаемые бактерии достаточно специфичны в отношении исследуемых тест-грибов, так как диаметры зон ингибирования роста фитопатогенов и степень характерных деформаций формирующегося мицелия под воздействием штаммов-антагонистов сильно варьировали (таблица 1). При совместном культивировании азотобактера и фитопатогенов на чашках Петри было выявлено, что степень воздействия на микромицеты определялась радиальным градиентом концентрации метаболитов бактерии, то есть вне зоны действия веществ формировался обычный мицелий гриба, а чем ближе к колонии бактерии, тем ярче были выражены аномалии в строении мицелия. Как видно из таблицы 1, наибольшей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенамВ 15 и 7 обладает-3. В результате антагонистической активности культур азотобактера зоны подавления роста грибов варьировали в пределах 4,3 - 25 мм в зависимости от штамма азотобактера и вида фитопатогена. При нанесении блоков с азотобактером на газоны грибов, ,наблюдали замедление роста, усыхание и лизис их мицелия. Микроскопия чашек с посевами показала,что воздействие азотобактера приводит не только к лизису грибного мицелия, но и к переходу гриба от активной стадии развития к спороношению, а именно к накоплению хламидоспор. Таблица 1 Спектр антагонистческой активности бактерий рода Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм 7 В 15 9,80,3 17,00,5 10,00,3 25,00,7 4,30,1 20,20,6 Результаты анализа антигрибной активности культур азотобактера показали, что их воздействие вызывало усыхание грибного мицелия и снижение уровня конидиеобразования. Выявленные изменения в популяционной структуре фитопатогенных грибов в результате обработки их азотобактером вселяют надежду на использование этой бактерии-антагониста в борьбе с возбудителями болезней сельскохозяйственных культур. Пример 2. Эффективность применения штаммов азотобактера для повышения урожайности и защиты пшеницы от корневой гнили В настоящее время весьма актуальна проблема получения принципиально новых препаративных форм, способных обеспечивать как защиту растений от возбудителей болезней, так и комплексное минеральное питание микробных клеток и растительного организма. Одним из таких биопрепаратов является азотобактерин,изготовленный на основе активных штаммов азотфиксирующих микроорганизмов,обеспечивающий азотфиксацию, контроль развития патогенов,продуцирование физиологически активных веществ. В связи с этим нами были созданы лабораторные образцы биопрепарата азотобактерин на основе новых штаммов,3 выделенных из южных карбонатных черноземов Северного Казахстана. Полевые испытания экспериментальных форм биопрепаратов проводили на базе стационарных опытов ТОО НПЦЗХ им. А.И. Бараева. На безазотистой жидкой среде Эшби на шейкерах наработана биомасса 5 штаммов азотобактера, с постоянным контролем температуры, рН и наличия сахара. Определен титр бактерий методом посева в чашки Петри с 4, 5, 6, 7 разведений. Наработанная биомасса бактерий была иммобилизована в структуру сероцеолита. Перед посевом была произведена инокуляция семян пшеницы в дозе 200 г препарата на гектарную норму семян. Посев пшеницы сорта Астана 2 проводился по стерневому фону 25 мая сеялками прямого посева СЗП - 2,1 на глубину 5-6 см. Норма высева семян пшеницы 2,5 млн/га. Повторность опыта 3-х кратная, длина делянки 31 м, ширина делянки 4,4 м, общая площадь 136,4 м 2. Изучая микробиологическую активность почвы под посевами пшеницы с биоминеральными препаратами,проводили наблюдения за накоплением азотобактера в почве экспериментальных вариантов. В полевых условиях на вариантах, где в структуру биоминеральных удобрений внедрялись клетки азотобактера, его количество увеличивалось (фиг.1). Активность азотфиксирующих бактерий родав почве экспериментальных вариантов неодинакова в течение вегетационного периода. Весной,к моменту полных всходов сельскохозяйственных культур азотобактер активизирует свою деятельность. На вариантах с применением штаммов азотобактера этот вид бактерий обнаруживается в два раза чаще, чем на контроле. В фазу цветения и полной спелости биопрепарат на основе .-3 повысил количество клеток азотобактера в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. В этом случае азотобактер действует как продуцент биологически активных веществ,стимулирующих микробиологические процессы в почве и ризосфере,а также действующих непосредственно на высшие растения Сероцеолиты являются адсорбентами, повидимому, они способствовали сохранению влаги,тем самым, способствуя развитию азотобактера в течение лета. Минеральные компоненты биопрепарата стимулировали увеличение микроорганизмов в почве, ускорение процессов минерализации растительных остатков, обогащая почву доступными,легкоусвояемыми азотобактером, органическими веществами. Результаты структурного анализа показали, что азотфиксирующие бактерии в большей степени положительно влияют на сохранность растений,число зерен в колосе, а также на массу 1000 семян. Урожайность яровой пшеницы в зависимости от использования различных штаммов азотобактера варьировала в пределах 23,2 - 27 ц/га (таблица 2). Таблица 2 Изменение элементов структуры урожая пшеницы в связи с применением штаммов азотобактера Вариант Контроль Максимальный уровень урожайности наблюдается на варианте с применением штамма-3 и составляла 25,1 ц/га. Разработка и освоение экологически чистых способов увеличения продуктивности зерновых культур в современном сельском хозяйстве привела к необходимости частичной замены традиционных азотных удобрений на микробиологические удобрения,состоящих из живых культур микроорганизмов Алексеева А.Е. - Физиологобиохимическая активность и биоразнообразие численности штаммов,выделенных из почв Нижегородской области. Диссна соискание к.б.н., НГУ им. Лобачевского,Нижний Новгород,2005.-с.141. Такие микроорганизмы должны повышать адаптивный потенциал растений за счет ряда механизмовфиксации молекулярного азота, мобилизации труднодоступных питательных веществ в почве,защиты корней от патогенов, синтеза фитогормонов 4 и витаминов и т.д. Разработка комплексных препаратов на основе азотфиксирующих бактерий,позволяет направленно регулировать численность и активность полезной и патогенной микрофлоры в ризосфере возделываемых растений, улучшить обеспеченность растений доступным азотом и снизить количество вносимых минеральных удобрений, что позволит повысить урожайность и качество получаемой продукции Емцев В.Т. Ассоциативный симбиоз почвенных диазотрофных бактерий и овощных культур // Вестник российской академии с- х. наук. -1994. 6. с.18-20 Бактерии рода обладают значительным потенциалом для создания биопрепарата на их основе, поскольку бактерии этого рода отвечают практически всем вышеуказанным требованиям. В острозасушливых условиях года развитие и распространение возбудителей корневых гнилей не было ограничено климатическими условиями. Синтез азотобактером ростовых веществ, таких как ауксины, гиббереллины, витамины может иметь существенное значение для растений,произрастающих в условиях недостаточной влажности. Благодаря воздействию на растение ростовых веществ, происходит быстрое удлинение зародышевого корня, позволяющего ему уходить из пересыхающего горизонта вглубь почвы, где лучшие условия снабжения влагой . Инокуляция азотобактером сопровождается лучшим развитием корневой системы, повышением поглощения минеральных элементов почвы и улучшением водного режима почвы Кравченко Л.В. Использование триптофана корневых экзометаболитов при биосинтезе ИУК ассоциативными бактериями / Л.В.Кравченко,Е.И. Леонова // Микробиология. - 1993. Т.62, В.3. с.453-459 Полученные нами данные совпадают с мнениями исследователей о благоприятном воздействии азотобактера на растения в ранние периоды развития,что подтверждает биологическая эффективность испытанных препаратов против корневой гнили, которая была довольно высокая 39,9 -61,6 (таблица 3). Хозяйственная эффективность обработки семян пшеницы азотобактерином -3 составила - 12,6. Таблица 3 Эффективность биопрепарата азотобактерина против корневых гнилей пшеницы Варианты Полученные нами результаты антагонистических и ростостимулирующих свойств предполагают дальнейшее их использование в защите растений от грибных болезней. Биопрепарат на основе штамма -3 оказался наиболее эффективным в борьбе с грибными болезнями. Пример 3. Влияние штаммов азотобактера на содержание питательных элементов почвы Содержание нитратного азота определяли дисульфофеноловым методом, подвижного фосфора- по методу Мачигина Радов А.С, Пустовой И.В.,Корольков М.В. Практикум по агрохимии. -М. Агропромиздат, 1985 Проведенный анализ почвы показал, что содержание нитратного азота -3 в почве под посевами увеличивается при внесении азотобактера(фиг.2). Максимальное содержание нитратного азота наблюдается при внесении азотобактера штамм-3 и -5. По уровню обеспеченности подвижными формами фосфора экспериментальные варианты с внесением бактериологических препаратов характеризуются как среднеобеспеченные. Содержание фосфора варьирует в пределах от 2,8 до 4,1 мг/ 100 г почвы. Действие биопрепаратов на накопление растениями азота может определяться рядом факторов, среди которых основное значение принадлежит обеспеченности растений азотом,которое в свою очередь зависит от фиксации его диазотрофами, а также усиления потребления растениями азота из почвы в результате микробостатического эффекта. Внесение азотобактера вызывает не только изменения в содержании гумуса, но и оказывает влияние на содержание подвижных форм азота и фосфора, усвояемых растениями. В почве Биологическая Хозяйственная эффективность препарата, эффективность препарата,39,9 7,2 61,6 12,6 53,2 6,2 увеличивается содержание нитратных форм азота,усиливается мобилизация легкорастворимых и наиболее доступных для высших растений форм фосфорных соединений. Таким образом, для обеспечения непрерывного притока азота в почву за счет фиксации атмосферного азота необходимо создать благоприятные условия для жизнедеятельности бактерий, способных фиксировать атмосферный азот. Результаты структурного анализа показали, что азотфиксирующие бактерии в большей степени положительно влияют на сохранность растений,число зерен в колосе, а также на массу 1000 семян. Урожайность яровой пшеницы в зависимости от использования различных штаммов азотобактера варьировала в пределах 23,2 - 27 ц/га (таблица 2). Фиг.3 - Содержание питательных элементов на южных карбонатных черноземах под посевами пшеницы на фоне применения штаммов азотбактера(в слое 0-20 см) Действие биопрепаратов на накопление растениями азота может определяться рядом факторов, среди которых основное значение принадлежит обеспеченности растений азотом,которое в свою очередь зависит от фиксации его диазотрофами, а также усиления потребления растениями азота из почвы в результате микробостатического эффекта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм-3,депонированный в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под регистрационным номером 0239,повышающий продуктивность пшеницы и обогащающий почву азотом. 5