Штамм Trichoderma album T-340 для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста зерновых культур и защиты от альтернариозной инфекции семян

(51) 12 1/00 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ биопрепарата, используемого для защиты зерновых культур от альтернариозной семенной инфекции. ШтаммТ 340 выделен из ризосферы мягкой яровой пшеницы сорта Акмола 2 методом серийных разведений. ШтаммТ 340 в условияхна встречных культурах на 7-ые сутки полностью колонизирует колонии грибов родаи лизировать мицелий патогена. Обработка семян пшеницы метаболитами штамма Т.340 увеличивает рост корешков и ростков в среднем на 77,7 и массу проростков - 137,1. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов МОН Республики Казахстан под регистрационным номером 158 (19 ноября 2008 г.) и предназначен для использования в сельском хозяйстве в борьбе с возбудителями альтернариоза зерновых культур.(72) Науанова Айнаш Пахуашовна Бисенов Жанабил Алдабергенович Жмабек Баытбек Жетбайызы Назкен(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ-340 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА,ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР И ЗАЩИТЫ ОТ АЛЬТЕРНАРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ СЕМЯН(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штаммаТ 340,который может быть использован для получения Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается нового штаммаТ 340,который может быть использован для получения биопрепарата, используемого для защиты зерновых культур от альтернариозной семенной инфекции. В последние годы отмечается расширение состава патогенных грибов в семенном материале зерновых культур в различных регионах стран СНГ. Увеличилась зараженность зерна пшеницы и ячменя возбудителями грибных болезней,возросла вредоносность грибов рода.,плесневых грибов, образующих канцерогенные вещества. Паразитные виды родазаражают растения в тот момент, когда их споры или мицелий встречаются с ослабленными органами растений. Обычно это более старые нижние листья растений. Если вид гриба достаточно вирулентен, то его внедрение в ткани растения большей частью выражается появлением пятен на листьях. Однако в начальные фазы развития растения паразит ведет скрытое существование на стебле или шейке,достигая нижних ослабленных листьев. Отсюда инфекция распространяется на другие органы растения, а в дальнейшем может достичь созревающих семян. В случае заражения зерна мицелий гриба проникает в перикарпий, эндосперм и зародыш. Поражение зародыша может вызывать гриб , который локализуется только в оболочках и редко достигает эндосперма. На формирующейся зерновке в области зародыша, на части или на всей ее брюшной поверхности появляются вначале светло-коричневые, затем темно-коричневые, и почти черные пятна на более поздние этапы органогенеза. С семенами гриб в виде спор или мицелия переносится на новое место выращивания растения и при благоприятных условиях влажности и температуры он может поражать растение уже в фазе прорастания. Грибы этого рода вызывают заболевание под общепринятым названием черный зародыш. Вредоносность альтернариоза семян выражается в снижении полевой всхожести (до 40,0), в уменьшении продуктивности растений,в понижении устойчивости их к корневым гнилям и в ухудшении хлебопекарных качеств зерна. Известен штамм бактерийдля получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты от грибов родаи бактерийА.с. СССР 1621508,кл. С 12 1/20, 1990. Этот штамм предназначен для стимуляции роста растений и ингибирования развития фузариозной инфекции огурца и редиса в тепличных условиях. Известны штаммыТ.Б. Кустова А.И., Петрухина М.Т., Воронкова Е.Н.,Сугоняева Э.К., Федосова Э.П., Софиенко И. А. и др. Штамм грибаТ.Б.,обладающий фунгицидными свойствами. А.с. 736925 от 30.05.80 иВКМ -2477 Успенская Г.Д., Гринько Н.Н. ШтаммВКМ 2477, используемый для защиты растений огурца от аскохитоза. А.с.1124473 от 30.03.91,2 обладающие фунгицидными свойствами против фитопатогенных грибов. Однако эти штаммы не являются антагонистами возбудителей альтернариоза семян зерновых и предложены для борьбы с болезнями овощных культур. Технической задачей изобретения является применение штамма, используемого в борьбе с альтернариозом семян и обладающего ростстимулирующими свойствами зерновых культур. Предложен штаммТ 340,обладающий фунгицидными свойствами против возбудителей альтернариоза семян с целью получения биопрепарата. ШтаммТ 340 выделен из ризосферы мягкой яровой пшеницы сорта Акмола 2 методом серийных разведений. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов МОН Республики Казахстан под регистрационным номером 0236 (15.11.2008 г.) и предназначен для использования в сельском хозяйстве в борьбе с возбудителями альтернариоза зерновых культур. В сравнении с известными штаммами имеет следующую характеристику Морфологические и культуральные признаки. На среде Чапека-Докса конидиальный газон зеленовато-желтого цвета, субстратный мицелий светло-зеленый, воздушный мицелий темнозеленого цвета, края колонии ворсистые. Диаметр колонии 75-90 мм. У штамма Т 340 разветвление конидиеносцев дихотомическое, на кончиках ветвей расположены 5 стеригм, около 5 мкм в длину. Споры круглые, с одного конца несколько заостренные, гладкие,величиной 1-3,5 мкм. Хламидоспоры интеркалярные,круглые, 6-8 мкм в диаметре (Фиг.1). На жидкой среде Чапека мицелиальная пленка зеленого цвета, диаметр 60 мм, толщина мицелия 23 мм. Физиологические свойства. Для штамма Т 340 наиболее благоприятными источниками являются натрий азотистокислый, барий азотнокислый, калий азотнокислый, магний азотнокислый. Из источников углерода усваивает арабинозу, рамнозу, галакто. Плохо осваивает Д-лактозу, при росте гриба на питательной среде с добавлением Д-лактозы колонии и раффинозу. Штамм является мезофилом, оптимальный интервал температур составлет 23-25 С. Для штаммаТ 340 оптимальная кислотность среды находится на уровне рН 6,8-7. ШтаммТ 340 обладает средней целлюлозолитической активностью фильтровальную бумагу лизирует за 5 суток. У выделенного штамма также выявлена высокая пектиназная активность разложение пектиновых веществ ломтика картофеля отмечается на третьи сутки замачивания культуральным фильтратом гриба. В опытах, проведенныхна среде Чапека с добавлением яичного желтка и крови,установлены признаки лецитиназной (21 колоний) и гемолитической активности (12 колоний). ШтаммТ 340 при совместном выращивании с патогенными грибами на 7-е сутки образует зоны ингибирования до 70. Биологическая эффективность против корневой гнили составляет 76,8,хозяйственная эффективность - 11,3. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма Хранение на скошенном агаре под вазелиновым маслом при 3 - 4 С. Среда Чапека (г/л) О 3 2,0 К 2 НРО 4 - 1,0 4 - 0,5 КС - 0,5 4, следы сахароза - 30 агар - агар - 20,0 дистиллированная вода - 1 л. Стерилизация 120 С 20 мин р - 6,8 - 7,0. Пересев 1 раз в 3 месяца,инкубация 5 суток при температуре 20 - 24 С. Лиофильное хранение при температуре не выше 0 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма Путем пересева кусочка мицелия на агаризованную среду Чапека, при температуре 24 С время культивирования 5-7 суток, затем пересевают на скошенный агар. Среда Чапека (г/л) 3 - 2,0 К 2 Р 4 - 1,0 4 - 0,5 К - 0,5 4 - следы агар-агар 20,0 дистиллированная вода - 1 л. Стерилизация 120 С - 20 мин рН - 6,8 -7,0. Пример 1. Влияние культуральных фильтратов штаммов триходермы на всхожесть семян и рост проростков зерновых культур В условияхнами изучено влияние штаммов триходермы на всхожесть семян и рост проростков сортов пшеницы Целинная Юбилейная,Дамсинская 90 и ячменя Целинный. Штаммы триходермы Т.340,Т.82,Т.350 и Т.34 культивировали на жидкой среде Чапека в течение 14 суток. Через 14 суток отфильтрововали КФ, затем обрабатывали семена зерновых культур метаболитами антагонистов. Спустя 10 суток у проростков измеряли длину ростков и корней, а также определяли массу проростков. Опыты показали, что отобранные 4 штаммов триходермы обладают различной стимулирующей активностью в отношении семян и проростков пшеницы. В результате проведенных опытов выявлено, что у сорта пшеницы Дамсинская 90 повышается всхожесть семян на 6,6-15,6 при обработке семян КФ Т.340, Т.350, Т.82 и Т.386. Отмеченные штаммы также показали ростстимулирующие свойства по отношению к росткам. Метаболиты штаммов Т.340 и Т.82 стимулировали рост корешков на 124,5140,8 по сравнению с контролем (табл. 1). Метаболиты штамма Т.340 положительно повлияло на формирование ростков пшеницы сорта Дамсинская 90, где длина роста составила 5,0 мм. Стимулирующее действие данного штамма отразилось на массе проростков пшеницы. Таблица 1 Влияние культуральных фильтратов штаммов триходермальных грибов на всхожесть семян,рост и развитие проростков пшеницы сорта Дамсинская 90 Вариант Отмечено снижение всхожести семян в среднем на 19 под действием КФ штаммов Т.350 и Т. 134. Однако их отрицательное влияние на развитие проростков не отразилось (табл. 2). Метаболиты штамма Т.340 стимулировали рост и развитие проростков и всхожесть семян сорта мягкой яровой пшеницы Целинная Юбилейная. Обработка семян метаболитами отмеченного штамма стимулировало рост первичных корешков семян, что привело к увеличению массы проростков на 183,3 по сравнению с контролем. В целом метаболиты штамма Т.340 увеличивали рост корешков и ростков сортов пшеницы Дамсинская 90 и Целинная Юбилейная в среднем на 77,7 и массу проростков - 137,1. Таблица 2 Влияние культуральных фильтратов штаммов триходермальных грибов на рост и развитие проростков пшеницы сорта Целинная Юбилейная Вариант Целинная Юбилейная Длина К контролю,ростков, мм Целинная Юбилейная Длина К контролю,ростков, мм Пример 2. Антагонистическая активность штаммов триходермы В двойной культуре учитывали встречную скорость роста колоний грибов, занимаемую площадь, размеры зон подавления и вычисляли гиперпаразитическую активность. Данные,полученные при оценке антагонистической активности выделенных штаммов методом встречных культур на третье сутки культивирования на среде Чапека, представлены в таблице 3. Изучая в лабораторных опытах взаимоотношения штаммов грибов рода триходерма с фитопатогенными грибами установили, что на 3 сутки они имеют различную удельную скорость на совместных культурах. Угнетение роста возбудителей альтернариоза наблюдалось на встречных культурах со штаммами Т.34, Т. 124,Т.385, Т.383, Т.340, Т.350. Под действием наиболее биологически активных штаммов Т.387, Т. 134,Т.124, Т.383, Т.456 и Т.384 наблюдалось сильное угнетение возбудителей корневых гнилей. По некоторым вариантам подавление роста патогенных грибов не отмечено, так как на третье сутки еще имелось не занятое пространство для роста и размножения. Оценивая гиперпаразитическую активность,следует отметить некоторые особенности взаимодействия изучаемых штаммов антагониста с патогенами. На встречных культурах поверхность колоний гриба . была полностью покрыта мицелием и спороношением антагонистов (табл.4). Таблица 3 Гиперпаразитическая активность антагонистов по отношению к возбудителям альтернариоза семян и рост встречных культур на 7-ые сутки культивирования Штамм антагониста взаимоотношение Гиперпаразитвзаимоотно Гиперпарази грибов с ическаяшт. 31 шение тическая антагонистами активность грибов с активность 11 В 0 0,5 В 1 1,4 1,33 Т. 386 1,53 Б 2 1,83 А 3 1,3 0,2 Т. 34 2,67 Б 3 2,83 Б 3 0,4 0,43 Т. 340 3,0 Г 4 1,57 Г 4 0,5 0,11 Т. 456 2,73 А 3 3,33 Г 4 1,0 0,33 Т. 383 1,47 Б 4 2,67 Г 4 0,8 0,13 Т. 350 2,42 А 3,4 Г 4 3 1,0 0,31 Т 82 1,17 В 0 2,03 Б 2 0,67 0,5 Примечание А- патоген угнетен в сильной степени, мицелий редкий и прижат к субстрату Б - патоген угнетен слабо В - патоген не угнетен Гпатоген полностью зарастает гиперпаразитом Примечание в числителе антагонист в знаменателе - патоген Отмечен гиперпаразитизм штаммов Т.456, Т.385 по отношению к штамму . шт.24,Испытанные штаммы грибов рода триходерма,кроме Т.82 и Т.387, угнетали рост возбудителей альтернариоза на седьмые сутки культивирования(Фиг.2). Различия проявились при взаимодействии изучаемых культур с видами грибов рода . В опыте все антагонисты оказывали фунгицидное действие и подавляли размножение гриба, причем антагонисты вызывали как ускоренное сокращение обитаемой площади питательной среды, так снижение жизнеспособных мицелий гриба. Отмечено наличие ингибирующего и фунгицидного действия у штаммов Т.340, Т.456 и Т.350 сразу к нескольким штаммам возбудителей альтернариоза зерновых культур. Среди испытанных штаммов Т.386 и Т.383 по отношению не во всех штаммов возбудителей альтернариоза имели антагонистические свойства. На встречных культурах, где были культивированы штаммы триходермы Т.34 и Т.82 патогены не были угнетены. В целом наиболее сильное ингибирование роста патогенов происходило под влиянием штаммов Т.340, Т.456 и Т.350, что является следствием их способности быстро колонизировать субстрат и лизировать мицелий патогена. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм-340,депонированный в РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК, под регистрационным номером - 0236, для получения биопрепарата, используемого для стимуляции роста зерновых культур и защиты от альтернариозной инфекции семян.