Штамм микроорганизма Escherichia coli BL 21 – продуцент рекомбинантного белка cagA Helicobacter pylori

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/108 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН- продуцент рекомбинантного белка. Изобретение относится к биотехнологии,микробиологии и может быть использовано в медицине для разработки и производства диагностических тест-систем,позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных-позитивных штаммов, а также контролировать эффективность проводимой терапии.(72) Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Кожахметов Самат Серикович Бекенова Элеонора Ербубековна Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Климович А.В., Самойлович М.П.,Суворов А.Н. Создание и характеристика рекомбинантных фрагментов белка Изобретение относится к биотехнологии,микробиологии и может быть использовано в медицине для разработки и производства диагностических тест-систем. Инфицирование бактериейвызывает развитие в слизистой оболочке желудка воспалительного процесса, что приводит к развитию хронического гастрита. До 20 инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни,аденокарциномы желудка и -лимфомы (, 2006). Патологические процессы, которые в большинстве случаев способствуют опухолевой трансформации, вызывают штаммы,продуцирующие цитотоксин( 2005). Этот белок является основным факторов патогенности Н. и считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток,секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия(, 2008, 2009). Выявление антител крекомендовано в качестве первичной диагностики инфекции данным патогеном. По заключениюМаастрихтской конференции, для диагностики инфекции рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (., 2007, 2008, 2010). Штамм микроорганизма 21 является основой для разработки и производства диагностических тест-систем, позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных позитивных штаммов, а также контролировать эффективность проводимой терапии. Известен штамм микроорганизма,продуцирующий рекомбинантный фрагмент цитотоксина . Фрагменты воспроизводят структуру высоко- и низко-иммуногенных областей молекулы,которые в совокупности воспроизводят всю аминокислотную последовательность этого белка (Климович А.В.,Самойлович М.П., Суворов А.Н. Создание и характеристика рекомбинантных фрагментов белка//ЖМЭИ. 2010. В. 2. с.74-79). Недостатком известного штамма микроорганизма, является то, что один штамм не перекрывает последовательность всего белка. Задачей изобретения является получение штамма микроорганизма,продуцента рекомбинантного белка. Штамм получали следующим образом Поиск нуклеотидной последовательности белка для использования в диагностической тест-системе для выявления высокопатогенных- позитивных штаммов проводили с использованием баз данныхи. Анализ первичных структур проводился с использованием пакета программ. Для получения штамма продуцента использовали штамм микроорганизма 21,2 плазмидный вектор рЕТ-28 с. Клеткивыращивали на жидкой и плотной питательных средах. В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали ДНК штамма 99. Плазмидную ДНК выделяли с помощью наборасогласно инструкциям производителя. Вставку фрагмента ДНК осуществляли по сайтам для рестриктази. Лигирование проводили набором для лигирования согласно протоколу производителя набора. Реакция лигирования заканчивалась после инкубации в течение 45 минут при комнатной температуре. Гидролиз плазмидной ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции в соответствующих буферных и температурных условиях согласно рекомендациям производителей. Трансформацию генетических конструкций проводили в клеткиштамм 2 для наработки плазмиды. Для трансформации клеток лабораторных штаммов 2 использовали метод теплового шока . При клонировании фрагментов ДНК в плазмидных векторах для поиска рекомбинантов использовали методы контрселекции на средах с антибиотиками и метод скрининга рекомбинантов с использованиеми -. Первичную структуру полученных плазмид определяли с помощью набора 3.1. Результаты секвенирования анализировали на генетическом анализаторе. Олигонуклеотиды заданной последовательности синтезировали на приборе 800 фосфоиммидным методом согласно Инструкции фирмы- производителя. Полученной экспрессионной плазмидой трансформировали компетентные клеткиштамма 2, трансформантов высевали на селективную среду с канамицином (50 мкг/мл). Выросшими колониями инокулировали 100 мл среды, культивировали до 6000.5 при 37 С. Затем индуцировали экспрессию гена добавлениемдо концентраций 0.2 мМ, 0.3 мМ, 0.5 мМ. После добавления индуктора культивировали индуцированную культуру 4-5 часов. После этого клетки собирали центрифугированием(300015 минут), промывали небольшим объемом охлажденногои разрушали ультразвуком с помощью дезинтегратора, следуя рекомендациям производителя прибора. Полученный лизат осветляли центрифугированием (40 000 в течение 45 мин). Штамм микроорганизма 21 продуцент рекомбинантного белка депонирован и хранится в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов(010000, г. Астана, ул. Валиханова,13/1) под регистрационным номером В -0491 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика штамм микроорганизма 21 представляют собой прямые грамотрицательные палочки, концы палочек закруглены, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства клетки культивируют в среде , в течение 24 часов при 37 С в анаэробных условиях. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют крупные, выпуклые,круглой правильной формы, полупрозрачные колонии мягкой консистенции. В жидкой питательной среде клетки образуют равномерное помутнение. Образуют индол, не образует сероводород. Продуктивность штамма для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда(триптон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37 С, в течение 18-24 часов до 6000,5. После добавляют 0,1 мМ изопропил - , - тиогалактопиранозид) и инкубируют при 37 С в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного белкасоставляет 1 мг/мл. Характеристика полезного продукта молекулярная масса рекомбинантного неструктурного белка синтезируемый штаммом составляет 133 кДа. Методы оценки специфичности МКА продукция белкаопределяется электрофорезом в СДС полиакриламидном геле( 4 // . 1970. - . 27. .680-685). Контаминация контаминантов в клетках включая,бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация криоконсервация с использованием , 20 глицерина, 10 сахарозы,10 поливинилпиролидона, концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Для лиофилизации используют защитную среду обезжиренное молоко в соотношении 11,концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Лиофильно высушенные образцы, при температуре хранения 4 С, - 20 С, -40 С и -80 С в течение 10 лет. Криоконсервированные образцы, при температуре хранение при -80 С, в течение 10 лет. Среда(4 С) на скошенном агаре (пересев 1 р./3 мес.) и под вазелиновым маслом в высоком столбике (пересев 1 р./г.) Условия размораживания замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл жидкой среды(пептон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводят 5 Мдистиллированная вода до 1 литра) и инкубируют при 37 С, в течение. 18-24 часов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Лиофильно высушенные образцы разводят в 1 мл стерильного физиологического раствора и пересевают в стерильную жидкую среду(пептон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра) и инкубируют при 37 С, в течение 18-24 часов Штамм микроорганизма 21 продуцент рекомбинантного белкаиспользуют следующим образом Компетентные клетки штамма микроорганизмаштамма 21 культивируют в 1000 мл среды(пептон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра, канамицин 50 мкг/мл), при температуре 37 С до 6000.5. Затем индуцируют экспрессию гена добавлениемв концентрации 0,2 мМ. После добавления индуктора клетки культивируют при 37 С и в течение 8 часов. Клетки,содержавшие наработанный рекомбинантный белок, осаждают центрифугироваием при 3000 в течение 20 минут,осадок промывают 1/3 объема физраствора,центрифугируют при 300020 минут и ресуспендируют в 10-30 мл буфера для металлаффинной хроматографии (25 мМ натрий-фосфатный буфер 7.4, 400 мМ , 20 имидазол). Клетки разрушают ультразвуком (22 , 4 раза по 20 секунд), нерастворимую фракцию отделяют центрифугированием при 50000 в течение 45 минут. Нерастворимую фракцию (осадок) ресуспендируют в 10 мл 25 мМ буфера для металл-аффинной хроматографии с 8 М мочевиной, инкубируют 1 час на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 50000 в течение 45 минут. Полученный таким образом осветленный лизат фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0.45 мкм) и подвергают металл-аффинной хроматографии. Рекомбинантный белок очищают на колонке(,США) с использованием хроматографической системы(,США). Элюцию проводят буфером (25 мМ натрийфосфатный буфер 7.4, 400 мМ , 20 имидазол,8 М мочевина). Ренатурацию рекомбинантного белка проводят с помощью диализа против 300-кратного объема 25 мМ натрийфосфатного буфера 7.25 с 300 мМ . Ренатурированный белок анализируют денатурирующим электрофорезом в 10 ПААГ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма 21 продуцент рекомбинантного белка, депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под номером 0491, являющийся основной для разработки и производства диагностических тест-систем