Штамм микроорганизма Escherichia coli B834/pET32/TprK – продуцент рекомбинантного периплазматического белка TprK Treponema pallidum – высокочувствительный и специфичный реагент для диагностики сифилиса методом иммуноферментного анализа

(51) 61 39/108 (2010.01) 12 15/31 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штамм 834/32/ продуцент рекомбинантного периплазматического белкаполучали путем трансформации экспрессионной плазмиды рЕТ 32 несущий ген периплазматического белкавозбудителя сифилиса. Изучение антигенных и биохимических свойств рекомбинантного периплазматического белкавозбудителя сифилиса проводили с использованием непрямого варианта иммуноферментного анализа,денатурирующего электрофореза в 15 полиакриламидном геле и иммуноблота. Для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда(бактотриптон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 10 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37, в течение 14-18 часов до 6000,8. После добавляют 0,1 мМ изопропил-,-тиогалактопиранозид и инкубируют при 30 в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного периплазматического белкавозбудителя сифилиса составляет 0,5 мг/мл. Молекулярная масса рекомбинантного периплазматического белкавозбудителя сифилиса синтезируемый штаммом составляет 47 кДа.(72) Мукантаев Канатбек Найзабекович Бакирова Гульнара Аманжоловна Лазарев Василий Николаевич Левицкий Сергей Алексеевич Шкарупета Марина Михайловна Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА 834/32/ ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕРИПЛАЗМАТИЧЕСКОГО БЕЛКА ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ И СПЕЦИФИЧНЫЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в здравоохранении при разработке методов серологической диагностики сифилиса, а также в микробиологии для изучения биологических свойств антигенов 25531 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в здравоохранении при разработке методов диагностики сифилиса. За последние годы, как в мире, так и в нашей стране усилилось внимание к проблемам эпидемиологии и профилактике инфекций передаваемых половым путем, в связи с их широким распространением среди всех групп населения. Сифилис в настоящее время представляют одну из наиболее актуальных проблем современного здравоохранения. Современное и качественное распознавание сифилитической инфекции связывается с широким внедрением специфических диагностических тестов,к числу которых относится иммуноферментный анализ (ИФА). Он имеет ряд преимуществ перед другими методами, обладая такими качествами лабораторного анализа,как специфичность,надежность, воспроизводимость, простота и возможность автоматизации. Для создания подобных систем анализа необходим тщательный подбор и получение рекомбинантных антигенов возбудителя, используемых в качестве мишеней для связывания антител из анализируемой сыворотки. Одним из таких антигенов является периплазматический белок, так как антиген гетерогенен среди различных штаммов возбудителя сифилиса и вызывает образование достаточно сильного иммуного ответа в больных сифилисом людей. На сегодняшний день известны работы ряда зарубежных исследователей по получению рекомбинантных белков,содержащих специфические антигенные детерминанты Т. для иммуноферментного анализа. Получены штаммы дрожжевых клеток продуценты специфического белка возбудителя с молекулярной массой 41 и 17 кД (Киселева В.Н., Беднова Г.А.,Дмитриев Г.А. Постановка иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса//Вести дерматологии 1998, 1, с. 39-41). Данный способ не обеспечивает достаточную чувствительность тестсистемы, в которой они использованы, так как в сенситине представлены не все антигенные детерминанты,которые обуславливают взаимодействие со всем спектром специфических антител, образующих на антигенные детерминанты возбудителя. Получен ряд рекомбинантных белков и синтетических пептидов, обладающих антигенной активностью естественных компонентов бледной трепонемы, молекулярная масса которых варьирует от 15 до 97 кД (Р.Каур, Х.Сильм, Г.Виндиревских,О.Шевчук. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя. ЭППП. 1998, 4 21 - 22). Недостаком данных белков и петидов является недостаточная селективность, в ряде случаев дает ложноположительные результаты, а тест-система включает достаточно дорогие и дефицитные компоненты. Наиболее близким к изобретению аналог полипептидов продуктов гена 15, 17, ТрА и 47, а также продуцент бета-галактозидазы выращивают на средес селективными добавками. Клетки собирают центрифугированием,разрушают ультразвуком. Тельца включения,содержащие рекомбинантные полипептиды,промывают с помощью центрифугирования,солюбилизируют. Полипептиды очищают с помощью хроматографических методов, чистоту полученных полипептидов анализируют с помощью ДДС-а-электрофореза (Изобретение 2103362,1998.01.27. Патентообладатель ТОО Биотехнологическая компания Биосервис, Россия). Однако известный метод предполагает использование при конструировании иммуноферментных тест-систем смесь рекомбинантных беоков-сенситинов с молекулярной массой 15, 17, 41-44,5 (ТрА) и 47. Бактериальный протеин с молекулярной массой 47 кДа вызывает продукцию антител, как при первичной, так и при вторичной стадиях заболевания. Сохранение позитивности результатов в отдаленные после окончания лечения сроки чаще всего связано с антителами, специфичными к антигену 17 кДа. Регистрация антител к белку Тр 15 позволяет подтвердить диагноз раннего первичного и врожденного сифилиса. Образование антител к белку ТрА завершается на стадии позднего сифилиса, эти антитела первыми исчезают после успешной терапии. Предлагаемый нами штамм отличаются от аналогов тем, что у этого белка показана существование достаточного сильного иммунного ответа. Кроме того, этот белок достаточно гетерогенен среди различных штаммов . , и следовательно, его применение может повысить специфичность разрабатываемой тест-системы. Другим аналогом изобретения являются штаммы продуценты рекомбинантных белков 15, 1747 полученные Н.А.(. .)). Однако данные рекомбинантые белки,предназначены для диагностики сифилиса методом гемагглютинации. Задачей изобретения является получение штамма, продуцента рекомбинантного периплазматического белкаТргК. Сущность данного технического решения состоит в том, с помощью методов генетической инженерии получен штамм-продуцент рекомбинантного периплазматического белкаТргК, который может быть использован в качестве продуцента антигена для конструиро-вания иммуноферментной тест-системы. Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в том, что при использовании штамма продуцента рекомбинантном периплазматического белкаТргК в имуноферментном анализе позволит существено поднять диагностическую ценность 25531 препаратов для выявления антител к возбудителю сифилиса. Штамм получали следующим образом. Поиск нуклеотидной последовательности периплазматического белкадля использования в диагностической иммуноферментной тест-системе проводили с использованием баз данныхи. Анализ первичных структур проводился с использованием пакета программ 9.0. Для получения штамма продуцента использовали штамм Е.5 и В 834,плазмидный вектор рЕТ 32 а. Клетки Е.выращивали на жидкой и плотной питательных средах . Плазмидную ДНК выделяли из штамма . 5 методом щелочного лизиса. 0,1 л среды 1 бакто-триптона, 0,5 дрожжевого экстракта. 1 заражали штаммом, несущим плазмиду и растили до оптической плотности 6000,7 - 0,8,затем добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 170 мкг/мл и инкубировали 14-18 часов при 37 и интенсивном покачивании. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием,ресуспендировали в 10 мл буфера (50 мМ глюкозы 25 мМ трис -8 10 мМ ЭДТА 5 мг/мл лизоцима). Инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 20 мл раствора,содержащего 0,2 Н , 1 . Инкубировали 10 минут на льду. Добавляли 15 мл 5 М ацетата калия, инкубировали 10 минут на льду,центрифугировали 20 минут 20 тыс. об/мин. К супернатанту добавляли 0,6 объема изопропанола и после 15 минут инкубации при комнатной температуре осаждали ДНК центрифугированием 30 минут 12 тыс. об/мин. Осадок промывали 70 этанолом и растворяли в буфере ТЕ. Плазмидную ДНК очищали изопикническим центрифугированием в градиенте плотностив присутствии бромистого этидия в вертикальном роторе -80 центрифуги 7-55 (, США). Разделение фрагментов ДНК проводили согласно Маниатису, методом электрофореза в горизонтальных агарозных гелях с концентрацией агарозы от 1 до 3. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере(0,04 М трис-ацетат 8,1 0,002 М ЭДТА) с содержанием 0,5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Препаративное разделение фрагментов ДНК проводилось в 0,8 агарозном геле. Фрагменты выделяли из геля методом электроэлюции. Полученный раствор ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформ и хлороформом, после чего преципитировали этанолом. Эффективность элюции контролировали методом электрофореза в агарозном геле. Гидролиз плазмидной ДНК проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции ,ив соответствующих буферных и температурных условиях согласно рекомендациям производителей. Для лигирования фрагментов ДНК использовали ДНК-лигазу фага Т 4. Состав буфера 250 мМ трис -7,2 25 мМ КС 1 5 мМ 2 10 мМ ДТТ 1 мМ трихлорида гексааминокобальта. Реакция лигирования заканчивалась после инкубации в течение 45 минут при комнатной температуре. Для трансформации клеток лабораторных штаммов . 834 использовали метод . Эффективность трансформации составляла 1075108 трансформантов на 1 мкг ДНК плазмиды рЕТ 32 а. При клонировании фрагментов ДНК в плазмидных векторах для поиска рекомбинантов использовали методы контрселекции на средах с антибиотиками и метод скрининга рекомбинантов с использованием изопропил-,-тиогалактопиранозиди -. Первичную структуру ДНК определяли по методус использованием наборовна автоматических анализаторах ДНК 3100,США). Синтез дезоксиолигонуклеотидов производили фосфоамидитным способом на автоматическом синтезаторе -700. Полученной экспрессионной плазмидой трансформировали компетентные клетки Е.штамма 834(3), трансформантов высевали на селективную среду с ампициллином (100 мкг/мл). Выросшими колониями инокулировали 100 мл среды(Ар 100 мкг/мл), культивировали до 6000,8 при 37 С. Затем индуцировали экспрессию гена добавлениемдо концентраций 0,1 мМ. После добавления индуктора температуру культивирования снижали до 28 и культивировали индуцированную культуру 4-5 часов. После этого клетки собирали центрифугированием (3000 15 минут), промывали небольшим объемом охлажденногои разрушали ультразвуком с помощью дезинтегратора УЗДН-2 (Россия), следуя рекомендациям производителя прибора. Полученный лизат осветляли центрифугированием (40 000 45 минут). Штамм микроорганизма 834/32/ продуцент рекомбинантного периплазматического белка ТргК возбудителя сифилиса депонирован и хранится в ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности под регистрационным номером В-341 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Штамм микроорганизма 834/32/ представляют собой прямые грамотрицательные палочки размером 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм, концы палочек закруглены, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Клетки культивируют в средев течение 24 часов при 37 в анаэробных условиях. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют крупные,выпуклые,круглой правильной формы,полупрозрачные колонии мягкой консистенции. В жидкой питательной среде клетки образуют 3 25531 равномерное помутнение. Образуют индол, не образует сероводород. Продуктивность штамма. Для получения максимального уровня полезного продукта применяется жидкая среда(бакто-триптон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 10 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра), инкубирование при 37, в течение 14-18 часов до 6000,8. После добавляют 0,1 мМ изопропил-,-тиогалактопиранозид и инкубируют при 30 в течение 2 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного периплазматического белка Трг возбудителя сифилиса составляет 0,5 мг/мл. Характеристика полезного продукта. Молекулярная масса рекомбинантного периплазматического белка ТгеропетаТргК синтезируемый штаммом составляет 47 кДа. Методы оценки специфичности антигена Продукция рекомбинантного периплазматического белка ТероетаТрг определяется электрофорезом в СДС полиакриламидном геле- 1970. - . 27. - . 680-685). Специфичность полученных антигенов определяется в иммуноферментном анализе. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. Криоконсервация с использованием , 20 глицерина, 10 сахарозы,10 поливинилпиролидона, концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Для лиофилизации используют защитную среду обезжиренное молоко в соотношении 11,концентрация клеток 109 КОЭ/мл. Лиофильно высушенные образцы,при температуре хранение 4, минус 20, 40 и 80 в течение 10 лет. Криоконсервированные образцы,при температуре хранение при -80, в течение 10 лет. Среда(4 С) на скошенном агаре (пересев 1 р./3 мес.) и под вазелиновым маслом в высоком столбике (пересев 1 р./г.). Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл жидкой среды(бакто-триптон- 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 10 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра) и инкубируют при 37 С, в течение 14-18 часов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Леофильно высушенные образцы разводят в 1 мл стерильного физиологического раствора и пересевают в стерильную жидкую среду(бактотриптон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 10 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная 834/32/ -продуцент рекомбинантного периплазматического белка Тероетаиспользуют следующим образом. Пример 1. Компетентные клетки Е.штамма В 834/рЕТ 32/Тр культивируют в 1000 мл среды(бакто-триптон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 10 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра, ампициллин 100 мкг/мл), при температуре 37 С до 6000,8. Затем индуцируют экспрессию гена добавлениемв концентраций 0,1 мМ. После добавления индуктора клетки культивируют при 30 и в течение 8 часов. Клетки Е. , содержавшие наработанный химерный рекомбинантный белок, осаждают центрифугироваием при 3000 в течение 20 минут,осадок промывают 1/3 объема физраствора,центрифугируют при 3000 20 минут и ресуспендируют в 10-30 мл буфера для металлаффинной хроматографии(25 мМ натрийфосфатный буфер 7,4, 400 мМ , 20 имидазол). Клетки разрушают ультразвуком (22,4 раза по 20 секунд), нерастворимую фракцию отделяют центрифугированием при 50000 в течение 45 минут. Нерастворимую фракцию(осадок) ресуспендируют в 10 мл 25 мМ буфера для металл-аффинной хроматографии с 8 М мочевиной,инкубируют 1 час на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 50000 в течение 45 минут. Полученный таким образом осветленный лизат фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0.45 мкм) и подвергают металл-аффинной хроматографии. Рекомбинантный белок очищают на колонке(,США) с использованием хроматографической системы(, США). Элюцию проводят буфером (25 мМ натрий-фосфатный буфер 7,4,400 мМ , 20 имидазол, 8 М мочевина). Ренатурацию рекомбинантного белка проводят с помощью диализа против 300-кратного объема 25 мМ натрий-фосфатного буфера 7,25 с 300 мМ. Ренатурированный белок анализируют денатурирующим электрофорезом в 15 ПААГ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма 834/32/ - продуцент рекомбинантного периплазматического белка, депонированный в ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,под регистрационным номером В-341,высокочувствительный и специфичный реагент для диагностики сифилиса методом иммуноферментного анализа.