Способ окрашивания опухолевых клеток миомы матки

(51) 61 10/00 (2009.01) 61 49/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МИОМЫ МАТКИ(57) Предлагаемый способ относится к области клинической медицины. Способ окрашивания опухолевых клеток миомы матки включает окрашивание мазков-отпечатков с миоматозного узла с применением раствора трипанового синего. Внедрение данного способа позволит прямое окрашивание апоптических клеток, количественно определить апоптоз и проводить мониторинг поведения клеток в зависимости от применения лекарственных средств.(72) Укыбасова Талшин Мухадесовна Жумагулова Сагира Сейткуловна Тусупкалиев Акылбек Балашович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Западно-Казахстанский государственный медицинский университет им. Марата Оспанова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Нисели Д. Практическая микротехника и гистохимия, 1965 Ганина К.П. Морфология,гистохимия и цитогенетика новообразований кожи человека, 1978 Предлагаемый способ относится к области клинической медицины. Миома матки - доброкачественная гормональнозависимая опухоль, развивающаяся в миометрии в результате гипертрофии и пролиферации элементов мышечной и соединительной ткани Миома матки является одним из наиболее распространенных гинекологических заболеваний. Есть данные, что среди женщин в возрасте 18-60 лет частота встречаемости миомы матки составляет в среднем 0,9. У жительниц городов это заболевание диагностируется у 1,1-4,7 женщин в сельской местности миома матки отмечается реже. По другим данным каждая 4-5-ая женщина в мире страдает миомой матки. Зарубежные авторы приводят значительно более высокие цифры. По их мнению, распространенность миомы в человеческой популяции среди женщин достигает 30 - 50. Известно,что способом окрашивания опухолевых клеток миомы матки является окраска по Романовскому - Гимзе с использованием красителей азур , азури эозин Килидля проведения морфоструктурного анализа (Нисели Д. Практическая микротехника и гистохимия, 1965 Ганина К.П. Морфология,гистохимия и цитогенетика новообразований кожи человека,1978). Недостатком этого метода является то, что протекающие в клетках процессы апоптоза устанавливаются по морфоструктурным изменениям ядерного апоптоза, которые можно спутать с процессом патологического деления опухолевых клеток, а именно отставание хромосом в метакинезе и анафазе, ассиметричные и многополюсные митозы. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа окрашивания клеток миомы матки путем применения красителя трипанового синего. Трипановый синий (синонимы трипановый голубой, трипан блау) - кислотный анилиновый краситель бензидиновой группы, представляющий собой зеленовато-синий порошок, который в воде дает полуколлоидный раствор. Данный краситель хорошо растворим в воде, плохо растворим в спирте, имеет в своем химическом составе 2 функциональные аминогруппы, которые принимают участие в реакции связывания с клеточными мишенями при окрашивании образцов, главным образом с основными аминокислотами (аргинином,лизином, оксилизином и гистидином). Наиболее важным значением является то, что водный раствор красителя связывается с основными аминокислотами цитоплазмы мертвых клеток,которые образуются в ходе ферментативного гидролиза белков, окрашивая ее в синий цвет, а в клетках, находящихся в состоянии апоптоза происходит окрашивание только хроматина в голубой цвет. Способ окрашивания опухолевых клеток миомы матки включает окрашивание мазков-отпечатков с миоматозного узла с применением водного раствора трипанового синего. Способ осуществляется следующим образом непосредственно перед началом анализа готовится рабочий раствор трипанового синего, для чего к 1 части 10 водного раствора красителя добавляют 3 части физиологического раствора. Затемполученной смеси доводят до 5,5-6,5 0,1 раствора. Мазок-отпечаток из миомы матки высушивают на воздухе. На мазок добавляют 50 мкл рабочего раствора трипанового синего, перемешиваем покачивая из стороны в сторону предметное стекло. На полученную смесь пипеткой наслаиваем 100 мкл вазелинового масла, после чего предметное стекло инкубируем в течение 15-20 минут при-37 С. По окончании инкубации под увеличением в 280 раз производят подсчет апоптических клеток. Для этого считают количество обнаруженных клеток с окрашенным в голубой цвет хроматином и прозрачной неокрашенной цитоплазмой в 100 встреченных на 1 участке препарата клеток. При этом возможно производить подсчет погибших (с окрашенным в синий цвет цитоплазмой) и нормальных (неокрашенных клеток). Подсчет производят не менее чем на 10 разных участках одного препарата, после чего находят среднее значение апоптотических клеток. Пример. Проведено исследование по 20 мазков отпечатков на содержание апоптических клеток окрашенных с помощью трипанового синего и краской Романовского-Гимзе. В мазках подсчитывали число мертвых клеток и апоптических клеток. В мазках по окраске с трипановым синим среднее число апоптических клеток составило 15 от всех погибших клеток, а по методу Романовскому-Гимзе 22, то есть в 1,46 раза больше. Это объясняется тем, что при подсчете апоптических клеток с применением краски Романовского-Гимзе процессы апоптоза устанавливаются по изменениям ядерного аппарата(блемминг плазматической мембраны, пикноз ядер,кариорексис, увеличением объема цитоплазмы,приобретение пузырчатого вида мембран). Но необходимо учитывать, что похожие признаки могут быть и при протекании процессов патологического опухолевого деления и поэтому,при подсчете возникает погрешность, что ведет к увеличению количества апоптических клеток. Применение же трипанового синего окрашивает только хроматин, что позволяет четко отличить их от погибших клеток с окрашенной цитоплазмой. Таким образом, применение трипанового синего для окрашивания мазков миомы матки для определения апоптоза,позволит лучше дифференцировать апоптические клетки и исключить ошибки, которые возникают при их подсчете. Внедрение данного способа позволит 1. более четкое дифференцирование апоптических клеток 2. количественно определить апоптоз 23732 3. провести мониторинг поведения клеток в зависимости от применения лекарственных препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ окрашивания опухолевых клеток миомы матки,включающий окрашивание мазка,отличающийся тем, что в качестве красителя используется трипановый синий в виде 10 водного раствора.