Штамм азотфиксирующих клубенькообразующих микроорганизмов Sinorhizobium fredii, используемый для получения биологического удобрения под сою

(51) 12 1/20 (2006.01) 05 11/08 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ оптимальных, способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Штамм 1 выделен из клубеньков на корнях растений сои,произрастающих на темно-каштановых почвах Алматинской области. Характеризуется способностью к росту в диапазоне температур 27-32 С и диапазоне 6,08,0. Штамм 1 способен образовывать биомассу на жидких ФН с кукурузным экстрактом, или на питательной среде с мелассой, или на соевой среде с глюкозой или сахарозой, или маннитом. При соблюдении условий ферментации через 48 часов культивирования титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Пастера, составляет не менее 4,2109 КОЕ/мл. Выделенный новый штамм быстрорастущих клубеньковых бактерий обладает высокой вирулентностью и способностью к накоплению азота в симбиозе с растениями сои. Использование биологического удобрения на основе нового штамма 1 способствует повышению урожайности сои на 10-11 и повышению содержания белка в бобах и зеленой части сои на 34.(72) Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Пуронен Светлана Владимировна Жусупова Акбота Мейрамовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ КЛУБЕНЬКООБРАЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения удобрения под сою. Целью изобретения является получение технологичного штамма, обладающего высокими адаптационными возможностями,быстрым наращиванием биомассы в условиях, отличных от Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в производстве биологических удобрений под сою. Обязательным приемом при культивировании сои является проведение предпосевной обработки семян биологическими удобрениями на основе активных штаммов симбиотических азотфиксирующих бактерий(нитрагинизация). Применение азотфиксирующих бактерий способствует повышению синтеза у растений сои фитогормонов белковой природы (ауксинов,гибберелинов, цитокининов), антибиотических и антифунгальных веществ. Накопление биологического азота способствует повышению урожайности сои при этом происходит накопление дополнительного количества белка в бобах. Для производства биологических удобрений под сою широко используются штаммы медленнорастущих симбиотических азотфиксирующих бактерий сои 206 ВКПМ В-9505, используемый для приготовления удобрения под сою (атент 2426778 кл. 12 1/00, 2009). Данный штамм обладает высоким уровнем вирулентности и активности. Недостатками является то, что в качестве источника углеродного питания данный штамм может использовать маннит, ограниченно глюкозу и сахарозу в смеси с маннитом. Известен штаммВКМ -2456(Патент 2413762 кл. 12 1/20, 2009),обладающий высокой вирулентностью, способный в качестве источников углерода использовать маннит,глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу. Недостатком штамма является низкая скорость роста и способность к образованию биомассы только при 7,0. Известен штамм симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов 32 (Резервы повышения эффективности соеводства,Новосибирск,1988,с.79-89),образующий биомассу при температуре 27-30 С, и использующий в качестве источника углерода маннит, глюкозу, сахарозу. Данный штамм обеспечивает повышение урожайности сои и содержания белка в бобах и зеленой части растений. Недостатком штамма 32 является низкая устойчивость к факторам окружающей среды. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штаммВКМ В-2458(Патент 2415924 кл. 12 1/20, 2009). Данный штамм быстро образует биомассу, способен к росту при температуре 27-32 С, в диапазоне 6,0-8,0,растет на плотной среде Норриса с маннитом и дрожжевым экстрактом, а также на жидкой соевой среде с различными источниками углерода(сахарозой,глюкозой,мальтозой,лактозой,маннитом) с образованием продуктов кислотного характера. Недостатком данного штамма является ограниченный спектр подходящих для культивирования питательных сред. Целью изобретения является получение технологичного штамма, обладающего высокими адаптационными возможностями,быстрым наращиванием биомассы в условиях, отличных от оптимальных, способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Технический результат изобретения достигается выделением нового штамма быстрорастущих клубеньковых бактерий, обладающего высокой вирулентностью и способностью к накоплению азота в симбиозе с растениями сои. Штамм,обладающий заданными свойствами, выделен из клубеньков на корнях растений сои,произрастающих на темно-каштановых почвах Алматинской области. Выделенный штамм 1 характеризуется следующими культурально морфологическими признаками. Морфологические признаки клетки представляют собой мелкие удлиненные палочки размером (2,3 2,5)0,4 мкм, в молодом возрасте подвижные. Спор не образуют. Оптимальная температура роста (281)С способен расти в диапазоне температур 27-32 С. Диапазонсоставляет 6,0-8,0 оптимум 7,0. Культура быстрорастущая. В чашках Петри на плотной соевой питательной среде колонии штамма образуются на 2-3 сутки. Колонии выпуклые, прозрачные,слизистые, диаметром 1,0-2,9 мм. При выращивании штамма в пробирках на скошенной соевой питательной среде при (281)С в течение 72 часов наблюдается обильный рост прозрачного штриха слизистой консистенции. Физиолого-биохимические признаки. В качестве источника углерода микроорганизмы штамма 1 способны использовать маннит, глюкозу, сахарозу,лактозу, мальтозу при сбраживании сахаров образуются продукты кислотного характера. Источником азота могут служить отвар соевой муки, дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат,кукурузный экстракт. По отношению к кислороду строгий аэроб. Фаги не выявлены. Штамм не патогенен (Заключение ТОО Нутритест 1-16/64 от 26 июня 2011 г). По Определителю Берджи штамм 1 идентифицирован как штамм вида. Штамм 1 депонирован и хранится в коллекции культур ТОО КАЗНИИППП под регистрационным номером В-362. Микроорганизмы 1 хорошо растут на плотных питательных средах следующего состава 1. Маннитно-дрожжевая среда. Состав, г/л фосфат калия двузамещенный - 0,5 сульфат магния- 0,8 хлорид натрия - 0,2 хлорид железа- 0,01 дрожжевой экстракт - 2,0 маннит или глюкоза или сахароза - 10,0 агар-агар - 15,0,среды 6,7-7,0. 2. Соевая среда. Состав, г/л фосфат калия двузамещенный 0,5 фосфат калия однозамещенный - 0,5 хлорид натрия - 0,1 сульфат магния - 0,1 сульфат кальция - 0,1 соль молибдена в следовых количествах маннит, или глюкоза, или сахароза, или мальтоза, или лактоза - 20 соевая мука - 10,0 агар-агар - 15,0,среды 6,8-7,0. Соевую муку, полученную путем размола предварительно пророщенных бобов сои, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, фильтрат,доводят до 1 литра, используют в качестве основы для приготовления питательной среды. При хранении чистой культуры на скошенной соевой среде в холодильнике при температуре 4 С консистенция и окрашивание штриха,вирулентность и нитрогеназная активность штамма не изменяются в течение 4-5 месяцев. Более длительное хранение штамма (до 3 лет) без потери основных свойств осуществляется в лиофильно высушенном состоянии при температуре не выше 4 С на защитной среде следующего состава сахароза - 100 г, желатоза - 30 г. дистиллированная вода - до 1 л. Получение посевного материала штамма 1 осуществляется в инкубаторе-шейкере при 200-220 об/мин,температуре 27-29 С,6,8-7,2, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на соевой среде с глюкозой объемом 100 мл. Состав соевой среды с глюкозой (г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 глюкоза техническая - 10,0 сульфат магния - 0,2 натрий хлористый - 0,2 молибдат аммония - 0,5 мл 0,02 раствора соевый отвар - до 1 л. Для получения соевого отвара 10 г муки из сухих пророщенных семян сои кипятят в 1 л водопроводной воды в течение 30 минут полученный отвар процеживают через ватномарлевый фильтр, доводят водопроводной водой до 1 л. При соблюдении указанных условий через 48 часов культивирования титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Пастера,составляет не менее 2,0109 КОЕ/мл. Ферментация микроорганизмов 1 осуществляется при температуре 27-29 С в течение 48 часов на питательной среде ФН, либо на питательной среде с мелассой, либо на соевой среде с глюкозой, или сахарозой, или маннитом. Состав среды ФН (г/л) кукурузный экстракт 6,0 фосфат калия двузамещенный - 0,5 глюкоза техническая - 10,0 сульфат магния - 0,2 натрий хлористый - 0,2 сульфат аммония - 0,5.среды 6,8-7,2. Состав питательной среды с мелассой (г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 аммоний сернокислый - 0,5 сульфат магния - 0,2 карбонат кальция - 3 хлорид натрия - 0,2 меласса - 2,0 кукурузный экстракт - 5,0. Состав соевой среды (г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 глюкоза техническая (или маннит, или сахароза) - 10,0 сульфат магния - 0,2 натрий хлористый - 0,2 молибдат аммония - 0,5 мл 0,02 раствора соевый отвар - до 1 л,среды 6,87,2. Для получения соевого отвара 10 г муки из сухих пророщенных семян сои кипятят в 1 л водопроводной воды в течение 30 минут полученный отвар процеживают через ватно марлевый фильтр, доводят водопроводной водой до 1 л. При соблюдении условий ферментации через 48 часов культивирования титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Пастера,составляет не менее 4,2109 КОЕ/мл. Использование биологического удобрения на основе нового штамма 1 способствует повышению урожайности сои на 1011 и повышению содержания белка в бобах и зеленой части сои на 3-4. Пример 1. Получение бактериального удобрения на основе микроорганизмов 1. Штамм 1 выращивали на скошенном соевом агаре в течение 72 часов при температуре 28 С. Биомассу смывали со скошенного агара 10 мл стерильного физиологического раствора, по 5 мл суспензии использовали для засева качалочных колб, содержащих жидкую соевую среду с глюкозой. Наработку посевного материала осуществляли в инкубаторе-шейкере при 200 об/мин, 28 С в течение 48 часов. Титр посевного материала после инкубации составил 3,1109 КОЕ/мл. 200 мл бактериальной суспензии использовали для засева ферментера объемом 7 л. Глубинное культивирование осуществляли при температуре 28 С,6,8-7,0, давлении 0,02-0,04 Мпа. Титр микроорганизмов 1 после 48 часов культивирования, определяемый по Пастеру,составил 6,5109 КОЕ/мл. Культуральная жидкость, полученная в результате ферментации 1, может быть непосредственно использована для инокуляции семян сои. Пример 2. Оценка вирулентности микроорганизмов штамма 1. Оценку вирулентности проводили в условиях лабораторного эксперимента. Семена сои предварительно стерилизовали последовательным погружением в 70 этиловый спирт, 33 перекись водорода, 70 этиловый спирт,промывали стерильной дистиллированной водой и проращивали на поверхности питательной среды в чашках Петри в течение 3 суток. Пророщенные семена помещали в пробирки с 10 мл питательной среды следующего состава (г/л) фосфат калия двузамещенный - 1,0 сульфат магния - 1,0 сульфит кальция - 0,5 сульфат железа, борная кислота,сульфат марганца, молибдат аммония - в следовых количествах, вода дистиллированная - до 1 лсреды - 6,8-7,2. Помещенные в пробирку семена инокулировали культуральной жидкостью,содержащей микроорганизмы 1 (из расчета 106 бактериальных клеток на 1 семя). Растения культивировали в лабораторных условиях в течение 21 суток в помещении поддерживали температуру 19-20 С, суточный режим дня и ночи 16 и 8 часов соответственно. После окончания культивирования подсчитывали количество клубеньков, образовавшихся на корнях растений, и определяли содержание общего азота в инокулированных растениях по сравнению с 3 контрольными (неинокулированными). В результате эксперимента показано, что штамм активен,обладает способностью к фиксации азота воздуха при вступлении в симбиоз с растениями сои. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм клубенькообразующих 1, депонированный в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности, под регистрационным номером В-362, используемый для получения биологического удобрения под сою.