Штамм азотфиксирующих микроорганизмов bradyrнizobium japonicum sr5, используемый для получения биологического удобрения под сою

(51) 12 1/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ адаптационными возможностями, способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Штамм 5 выделен из клубеньков на корнях растений сои,произрастающих на темно-каштановых почвах Алматинской области. Характеризуется способностью к росту и сохранению вирулентности в климатических и почвенных условиях Северного Казахстана. Штамм 5 способен образовывать биомассу на жидких питательных средах - на маннитно-дрожжевой питательной среде,либо на соевой среде с глюкозой или маннитом. При соблюдении условий ферментации через 120 часов культивирования титр жизнеспособных клеток,определяемый по методу Коха, составляет не менее 2,5109 КОЕ/мл. Выделенный новый штамм симбиотических азотфиксирующих клубеньковых бактерий обладает высокой вирулентностью в условиях почв Северного Казахстана.(72) Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Пуронен Светлана Владимировна Жусупова Акбота Мейрамовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Н 5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для получения удобрения под сою. Задачей изобретения является получение активного штамма,обладающего высокими Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано в производстве биологических удобрений под сою. Обязательным приемом при культивировании сои является проведение предпосевной обработки семян биопрепаратами на основе активных штаммов симбиотических клубенькообразующих азотфиксирующих бактерий. Применение азотфиксирующих бактерий способствует накоплению повышенного количества белка в бобах сои, усиленному синтезу фитогормонов белковой природы, таких как ауксины, гибберелины,цитокинины, образованию тканями растения антибиотических и антифунгальных веществ. В целом накопление биологического азота способствует повышению урожайности сои. Для производства биологических удобрений под сою широко используются штаммы активных симбиотических азотфиксирующих бактерий сои. Известен штаммВКМ-2456 (Патент 2413762 кл. 12 1/20,2009), обладающий высокой вирулентностью,способный в качестве источников углерода использовать маннит, глюкозу, сахарозу, мальтозу,лактозу. Недостатком штамма является его способность к росту при значениях рН, близких к 7,0, в то время как рН почв Северного Казахстана колеблется от слабощелочной до щелочной (рН 7,2-8,0), что затрудняет развитие штаммаВКМ В-2456 в естественных условиях. Известен штамм 206 В-9505, используемый для приготовления удобрения под сою (Патент 2426778 кл. 12 1/00, 2009). Данный штамм выделен из клубеньков сои, районированной в Белгородской области,отселекционирован методом перекрестного инокулирования с целью достижения вирулентности к другим различным сортам сои, культивируемым в Белгородской области и в других областях Центрально-Европейской части России. Недостатком данного штамма является низкая активность и вирулентность в климатических условиях Северного Казахстана. Известен штамм симбиотических азотфиксирующих микроорганизмовВКМ -2458 (Патент 2415924 кл. 12 1/20, 2006), образующий биомассу при температуре 27-30 С, и использующий в качестве источника углерода маннит, глюкозу, сахарозу. Данный штамм обеспечивает повышение урожайности сои и содержания белка в бобах и зеленой части растений при культивировании сои на лугово-черноземовидной почве. Недостатком штаммаВКМ -2458 является низкая вирулентность в условиях каштановых почв Северного Казахстана. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм клубенькообразующих бактерийВКМ -2455 (Патент 2415925 кл. 12 1/20, 2006). Данный штамм обеспечивает повышение урожайности и качества 2 семян сои и обладает высокими адаптационными возможностями. Недостатком штамма является то,что в качестве источника углерода данный штамм может использовать только маннит. Задачей изобретения является получение активного штамма,обладающего высокими адаптационными возможностями, способностью образовывать биомассу на питательных средах различного состава. Технический результат изобретения достигается выделением нового штамма симбиотических клубеньковых азотфиксирующих бактерий,обладающего высокой вирулентностью и способностью к вступлению в симбиоз с растениями сои в климатических и почвенных условиях Северного Казахстана. Штамм, обладающий заданными свойствами, выделен из клубеньков на корнях растений сои, произрастающих на темнокаштановых почвах Алматинской области. Выделенный штамм 5 характеризуется следующими культурально морфологическими признаками. Морфологические признаки мелкие удлиненные палочки размером (2,3-2,5)0,4 мкм, в молодом возрасте подвижные,спор не образуют. Температурный диапазон роста 27-30 С. Оптимальная температура роста 28 С. Хорошо растут на маннитно-дрожжевом агаре и соевой среде с маннитом или глюкозой. Культура медленнорастущая. В чашках Петри на маннитносоевой плотной питательной среде вырастают на 15 сутки, образуя выпуклые, молочно-белые,слизистые колонии диаметром 1,0 - 3,0 мм. При выращивании штамма в пробирках на скошенной маннитно-соевой питательной среде при 28 С в течении 360 часов наблюдается обильный рост штриха слизистой консистенции молочно-белого цвета. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4 С консистенция штриха не изменяется. Физиолого-биохимические признаки. В качестве источника углерода микроорганизмы штамма 5 способны использовать маннит или глюкозу при сбраживании сахаров образуются продукты щелочного характера. Источником азота могут служить отвар соевой муки, дрожжевой экстракт,дрожжевой автолизат. По отношению к кислороду строгий аэроб. Фаги не выявлены. Штамм не патогенен (Заключение ТОО Нутритест 116/167 от 26.06.11 г). По Определителю бактерий Берджи штамм 5 идентифицирован как штамм вида. Штамм 5 депонирован и хранится в коллекции культур ТОО КАЗНИИППП под регистрационным номером В-366(свидетельство о депонировании от 25.08.11 г.). Микроорганизмы 5 хорошо растут на плотных питательных средах следующего состава 1. Маннитно-дрожжевая среда. Состав, г/л фосфат калия двузамещенный - 0,5 сульфат магния дрожжевой экстракт -2,0 маннит или глюкоза - 10,0 агар-агар - 15,0, рН среды 6,7-7,0. 2. Соевая среда. Состав, г/л фосфат калия двузамещенный 0,5 фосфат калия однозамещенный - 0,5 хлорид натрия - 0,1 сульфат магния - 0,1 сульфат кальция - 0,1 соль молибдена в следовых количествах маннит, или глюкоза - 10 соевая мука - 10,0 агар-агар - 15,0, рН среды 6,8-7,0. Соевую муку, полученную путем размола предварительно пророщенных бобов сои, заливают 1 литром воды и кипятят в течении 30 минут. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, фильтрат доводят до 1 литра, используют в качестве основы для приготовления питательной среды. При хранении чистой культуры на скошенной соевой среде в холодильнике при температуре 4 С консистенция и окрашивание штриха,вирулентность и нитрогеназная активность штамма не изменяются в течении 4-5 месяцев. Более длительное хранение штамма (до 3 лет) без потери основных свойств осуществляется в лиофильно высушенном состоянии при температуре не выше 4 С на защитной среде следующего состава сахароза - 100 г, желатоза - 30 г., дистиллированная вода - до 1 л. Получение посевного материала штамма 5 осуществляется в инкубаторе-шейкере при 180-190 об/мин,температуре (281)С, рН 6,8-7,2, в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на соевой среде с маннитом или глюкозой объемом 200 мл. Состав соевой среды с глюкозой (г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 маннит или глюкоза техническая - 10,0 сульфат магния - 0,2 натрий хлористый - 0,2 молибдат аммония - 0,5 мл 0,02 раствора соевый отвар - до 1 л. Для получения соевого отвара 10 г муки из сухих пророщенных семян сои кипятят в 1 л водопроводной воды в течении 30 минут полученный отвар процеживают через ватно-марлевый фильтр,доводят водопроводной водой до 1 л. При соблюдении указанных условий через 96 часов культивирования титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Коха, составляет не менее 3,0109 КОЕ/мл. Ферментация микроорганизмов 5 осуществляется при температуре(281)С в течении 120 часов на маннитнодрожжевой питательной среде, либо на соевой среде с глюкозой или маннитом. Состав маннитно-дрожжевой питательной среды(г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 сульфат магния - 0,8 хлорид натрия - 0,2 хлорид железа- 0,01 дрожжевой экстракт - 2,0 маннит или глюкоза - 10,0 рН среды 6,7-7,0. Состав соевой среды (г/л) фосфат калия двузамещенный - 0,5 маннит или глюкоза техническая - 10,0 сульфат магния - 0,2 натрий хлористый - 0,2 молибдат аммония -0,5 мл 0,02 раствора соевая мука - до 10,0. рН среды 6,8-7,2. При соблюдении условий ферментации через 120 часов культивирования титр жизнеспособных клеток, определяемый по методу Коха, составляет не менее 2,5109 КОЕ/мл. Пример 1. Получение жидкой формы бактериального удобрения на основе микроорганизмов 5. Штамм 5 выращивали на скошенном соевом агаре в течении 240 часов при температуре (281)С. Биомассу смывали со скошенного агара стерильным физиологическим раствором. Полученную суспензию микроорганизмов использовали для засева колб Эрленмейера, содержащих жидкую соевую среду с глюкозой (из расчета 10 мл суспензии на 200 мл питательной среды). Наработку посевного материала осуществляли в инкубаторе-шейкере при 180 об/мин, температуре (281)С в течении 96 часов. Титр посевного материала после инкубации составил 3,2109 КОЕ/мл. В ферментер объемом 10 л вносили маннитно-дрожжевую питательную среду объемом 7,6 л. Исходный рН среды - 6,8. Для засева данного количества питательной среды использовали 400 мл посевного материала (количество посевного материала в итоговом объеме составило 5). Глубинное культивирование осуществляли при температуре(281)С, скорости перемешивания 300 об/мин,воздухообмене 4 л/мин. Титр микроорганизмов 5 после 120 часов культивирования, определяемый по камере Горяева,составил 8,7109 кл/мл, титр по Коху составим 2,7109 КОЕ/мл. Культуральная жидкость,полученная в результате ферментации 5, в разведении в 1000 раз может быть использована для инокуляции семян сои. Пример 2. Оценка вирулентности микроорганизмов штамма 5 в условиях каштановой почвы Северного Казахстана. Оценку вирулентности проводили в условиях мелкоделяночного эксперимента на территории Селетинского района Акмолинской области. Штамм 5 культивировали в пробирках на скошенной соевой среде с маннитом при температуре (281)С в течении 10 суток. Инокуляцию семян сои сорта Алматы проводили в день посева. Для получения инокулята в пробирки с микроорганизмами вносили по 2,0 мл раствора молибдата аммония (25 г молибдата аммония на 1 литр стерильной водопроводной воды). Путем встряхивания пробирки получали однородную бактериально-молибденовую суспензию, которой сразу обрабатывали семена сои из расчета 1 мл суспензии на 100 г семян. Затем семена сои перемешивали, подсушивали в тени и высевали в подготовленную почву. Растения культивировали в полевых условиях с соблюдением основных требований агротехники. После окончания культивирования и образования семян определяли количество клубеньков, образовавшихся на корнях растений. В среднем количество клубеньков составило 20 на одном растении, масса одного 3 активного клубенька - 0,32-0,33 г. Полученные данные свидетельствуют о сохранении вирулентных свойств штамма в климатических и почвенных условиях Северного Казахстана. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм 5,депонированный в Депозитарии ТОО Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности под номером В-366, используемый для получения биологического удобрения под сою.