Изолированный штамм Lactobacillus sakei B-RKM 0559, используемый в пищевой промышленности и в сельском хозяйстве в целях подавления роста патогенной бактерии Listeria monocytogenes

(51) 12 1/20 (2006.01) 01 63/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ В ЦЕЛЯХ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ПАТОГЕННОЙ БАКТЕРИИ(57) Изобретение относится к биотехнологии,пищевой промышленности, а также сельскому хозяйству и представляет собой новый штаммВ -0559, который подавляет рост патогенных бактерий, в том числе особо патогенный микроорганизм,контаминирующих продукты питания и корма для сельскохозяйственных животных. Была проведена паспортизация данного штамма с помощью методики и неспецифических праймеров,которая дает возможность защиты правообладателей данной культуры от его несанкционированного использования в аналогичных биотехнологических процессах.(72) Молдагулова Асель Кожахановна Уразова Майра Салаватовна Джаилбекова Айгуль Серикпаевна Каирова Мархабат Жайлауовна Шайхин Серик Мурзахметович Ли Константин Григорьевич Сытник Игорь Иванович Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности и сельском хозяйстве в целях подавления роста нежелательной микрофлоры и в том числе патогенной бактерии. Известен изолированный штамм микроорганизма 21380 как противомикробный и гипотензивный пробиотик и применение упомянутого микроорганизма для получения гипотензивного лекарственного средства и как способ подавления патогенов и побочных лактобактерий в продукте питания (Патент РФ 2477750). Недостатком известного штамма является то, что данный штамм был выделен из кишечника клинически здорового ребенка, он применяется в основном в качестве пробиотического штамма, то есть в составе препаратов для нормализации микрофлоры кишечника человека, исследования по его влиянию на качественные характеристики продуктов питания не проводились. Известен бактериоцин штамма 2512 против листерий. Бактериоцин сакацинштамма 2512 используют в составе бактерицидной композиции, обладающей способностью подавлять рост Гр патогенных бактерий, в частности,(Патент РФ 2250267). Недостатком известного штамма, прежде всего,является то, что исследователями предложен бактериоцин, то есть белок секретируемый штаммом 2512, а в ходе производственного процесса он может подвергнуться действию различных ферментов,протеаз, что приведет к потере его активности. Изолированный штамм 0559, выделенный из национального продукта питания азы, подавляющий рост условнопатогенной микрофлоры, в том числе. Рекомендуется в качестве стартерной культуры или биоконсерванта при производстве мясомолочной продукции и в сельском хозяйстве для обработки кормов. Внешний вид имеет паспорт о депонировании в музее РГП Республиканская коллекция микроорганизмов с присвоенным номером 0559. Описание изобретения Лактобактерии,использованные для получения ферментированных пищевых продуктов, применяются столетиями. В течение прошлых десятилетий лактобактерии широко использовались в качестве пробиотиков и в качестве продуцентов биологически безопасных консервантов(бактериоцинов) в пищевой промышленности. Применение и производство бактериоцинов в промышленных масштабах сопряжено с рядом сложностей во-первых выделение чистого бактериоцина является дорогостоящим и наукоемким процессом, во-вторых бактериоцины, представляющие собой белки, как правило нестабильны и могут разрушаться под действием различных факторов, сопряженных с производственным процессом, а также под действием протеаз. Поэтому инновационным подходом на данный момент является выделение бактериоциногенных штаммов непосредственно из продуктов питания,так как в этом случае сами бактерии, как и их бактериоцины, могут быть использованы в качестве природных биологических консервантов. Но при этом необходимо учитывать влияние штамма на вкусовые характеристики конечного продукта. Новый изолированный штамм- 0559, является продуцентом бактериоцина класса 2, сакацина. Штамм 0559 относится к гетероферментативным лактобациллам, он был выделен нами из мясного национального продукта питания азы, обладает рядом ценных свойств, одним из которых являются высокие показатели антагонистической активности в отношении основных патогенных штаммов,контаминирующих продукты питания, в том числе по отношению к особо опасному микроорганизму. Использование данного штамма при производстве мясных полуфабрикатов не повлияет на вкусовые характеристики продуктов,а также продлит срок их хранения. Культурально-морфологические характеристики были выявлены после культивации вагаре и. Клетки- 0559 являются грамположительными, неспороносными палочками правильной формы, встречающимися поодиночке,парно или в коротких цепочках. Физиологические и биохимические показатели Культивацию штамма в бульонной среде проводили в течение 24 часов, в микроаэробных условиях, после чего наблюдали рост в виде осадка,газа не образует. Колонии на чашках Петри с агаром после 48 часов роста при 37 С являются круглыми,в диаметре 1,5-2 мм, цельными, плоскими, белыми. Оптимальная температура роста 37 С, оптимальный уровень- 6,5. Была изучена биохимическая активность штамма- 0559 с помощью набора 50 (,Франция). Углеводородный профиль согласно данному тесту был следующим положительная реакция на -арабинозу, рибозу, Д-ксилозу, Дгалактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, ацетилглюкозамин, эскулин, целлобиозу, мальтозу,лактозу, мелибиозу, сахарозу, инулин, раффинозу,генциобиозу, глюконат. Является умеренным кислотообразователем, при сквашивании молока, первый сгусток образуется только после 24 часов, вкусовые характеристики конечного продукта сквашивания схожи с ряженкой, вкус мягкий, слабокислый, аромат приятный кисломолочный, консистенция продукта плотная, густая, не вязкая, сыворотка не отделяется. Данные качества определяют данный штамм как производственно ценный, так как его применение не вызовет у продукта изменение вкусовых качеств в сторону повышения кислотности. Может применяться в составе композиции других стартерных культур,используемых при ферментировании продуктов. Генотипирование- 0559 методом секвенирования 16 Для определения нуклеотидной последовательности 16 проводили ПЦР с использованием праймеров 8(5-3) и 806 (5-3),которые являются универсальными для бактерий. Очистку и разделение фрагментов гена проводят с помощью автоматического секвенатора 310( , США), согласно инструкциям фирмы-производителя. ДНК-маркирование штаммов лактобацилл вида, выделенного из национального мясного продукта азы с помощьюметодики. Получение-профилей с использованием неспецифических праймеров - как средство стабильного маркирования. Паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью методики - и неспецифических праймеров дает возможность защиты правообладателей бактериальных культур от несанкционированного использования штаммов в аналогичных биотехнологических процессах. В этом плане воспроизводимые профили фрагментного состава продуктов ПЦР геномной ДНК с неспецифическими праймерами могут быть удобными и информативными показателями стабильности коллекционных культур на уровне генома. Они также могут способствовать быстрой идентификации исследуемого объекта при условии накопления достаточного количества данных ранее надежно идентифицированных объектов (к примеру,по нуклеотидным последовательностям вариабельных областей генов рибосомных РНК). Последовательности праймеров и их характеристики приведены в таблице. Таблица Олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров,синтезированы в Лаборатории органического синтеза Национального Центра Биотехнологии РК. Начальные условия проведения реакций (объем реакционной смеси, концентрации матрицы, праймеров, 2, температура отжига,количество и тайминг циклов амплификации) использовали согласно литературным данным. Оптимизация условий ПНР с праймерами,последовательность которых была определена по литературным данным,заключалась в конкретизации параметров постановки реакций Оптимизированные условия постановки - микромицетов праймер М 13 Т 3 В Фиг.1 - -профили с использованием неспецифических праймеров (А. Т 3 В, Б. , С. М 13) различных штаммов, выделенных из азы , 7 и 8 колонки образцы штамма 0559. Рисунок наглядно демонстрирует различия между паттернами, отражающими полиморфизм расположения участков генома изолятов Антагонистическая активность изучалась несколькими методами по отношению к тест-штаммам . ,.,, . методом отсроченного антагонизма по отношению кметодом агаровых блоков бактериоциногенная активность изучалась с применением методики, описанной(2012), где проверяется активность 3 модификаций супернатантов бесклеточной жидкости изолятов лактобацилл. Таблица Антагонистическая активность штамма- 0559 по отношению к основным патогенным штаммам, являющимся контаминантами продуктов питания. Тест-штаммы Диаметр зоны подавления роста тест-культуры штаммом- 0559 (мм) 3.- 0600 Тест-культураВ-0600 была выделена от павшего верблюда к/х Абен(Мангистауская область, Бейнеуский район) в апреле 2012 года, он хранится в коллекции депонированных штаммов РГП Национального референтного центра по ветеринарии. На базе данного предприятия проводились эксперименты по выявлению антагонизма молочнокислых культур по отношению к листерии, в виду того, что данный Диаметр зоны подавления роста тест-культуры штаммом- 0559 (мм) 20.11.7 15.51.7 25.21.5 22.80.1 25.11.6 микроорганизм патогенных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Изолированный штамм,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмовпод номером 0559, используемый в пищевой промышленности и в сельском хозяйстве в целях подавления роста патогенной бактерии.