Штамм бактерии listeria monocytogenes b-0197 казниви, используемый для приготовления антигена при диагностике листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации

(51) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штаммВ- 0197 КазНИВИ, используемый для приготовления антигена при диагностике листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании вирулентного штамма. Штамм бактерийВ - 0197 КазНИВИ депонирован в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления антигена при диагностике листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации.(72) Егорова Наталья Николаевна Мусаева Асия Кыблашевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт-0197 КАЗНИВИ,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЛИСТЕРИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм,используемый для приготовления антигена для серологической диагностики листериоза сельскохозяйственных в реакции агглютинации. Известен штамм бактерий, используемый для изготовления биофабричного антигена для диагностики листериоза в пробирочной реакции агглютинации производства Ставропольской биофабрики Бакулов И. А., Котляров В. М. Ветеринарные препараты. М.,1981, с.255. Недостатком известного штамма является возможность утраты вирулентности вследствие длительных пересевов и отсутствия пассажей на восприимчивых животных (крупном рогатом скоте и овцах). Задачей данного изобретения является получение высоковирулентного штамма 1 серотипа с типичными культурально-морфологическими, биохимическими,антигенными свойствами. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании вирулентного штамма,пригодного для получения диагностикума. Штамм бактерийВ - 0197 КазНИВИ депонирован в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления антигена при серологической диагностике листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации. Идентификацию штамма бактерий проводят по основным культурально - морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю бактерий Берджи. Том 2, с.574-575,М., 1997 г. ШтаммВ-0197 КазНИВИ О-12 выделен из печени годовалой овцы,принадлежавшей частному владельцу из к/х И. Жансугурова Аксуского района, Алматинской области. Печеночную ткань засевали пастеровской пипеткой в мясопептонный бульон (МПБ). Культивировали в термостате при 37 С в течение 18 20 часов. Отмечалось равномерное помутнение МПБ. Затем с МПБ делали посевы на средуи на мясопептонный агар (МПА). При посеве отдельных колоний, выделенных с МПА на чашках Петри, отмечалось, что при пересеве их в МПБ при 20 часах инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1,0 см 3 на 10,0 см 3 МПБ отмечалось неодинаковое накопление бакмассы. Значительная временная разница в интенсивности роста, выделенной от овцы культуры, указывала на неоднородность популяции 2 по репродуктивной активности, накоплению бакмассы и скорости роста. Исходя из результатов исследований, в целях получения однородного популяционного свойства листериозных бактерий,обладающих сравнительно короткой лагфазой,2 сопровождающейся накоплением более высоким количеством бактериальной массы, были проведены исследования по селекции отдельных колоний л истерий с активными ростовыми свойствами. С этой целью методом разведений выделяли клоны листерий, выросших на чашках Петри с МПА, которые при последующем посеве в пробирки с МПБ давали наиболее обильный рост. Накопление бактериальной массы определяли по бактериальному одномиллиардному бактериальному стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Селекционное выделение клонов,отличающихся по скорости репродукции, проводили последовательно трехкратно,затем клоны размножали и после этого изучали их активность по наибольшему накоплению бактериальной массы. В результате проведенного клонирования был выделен изолят 12 из популяции штаммаВ-0197 КазНИВИ О-12, который был отобран для дальнейшей работы, так как за 18 часов культивирования в термостате на МПБ накопление бактериальной массы составляло более 3 миллиардов микробных клеток в 1,0 см МПБ. У остальных клонов этот показатель был несколько ниже (около 0,5-1 млрд. м. к./см и ниже). При повторной проверке выбранного штамма(изолят 12) через 3 месяца после хранения на полужидком агаре (ПЖА) под вазелиновым маслом под резиновыми парафинированными пробками была установлена стабильность клона в быстроте роста, что указывало на целесообразность его использования при проведении дальнейших исследований по отбору штамма для изготовления диагностического препарата. Изолят 12 был условно обозначен штаммомВ-0197 КазНИВИ О-12. Морфологические признаки.- мелкие палочки с закругленными концами, тонкие, иногда изогнутые палочки, реже овоидной формы, 1-2 мкм в длину и 0,5 мкм в ширину, располагающихся одиночно и попарно. Листерии представляют собой грамположительные,подвижные палочки, с одним длинным, полярно находящимся жгутиком, несколько грубые. Наличие активной подвижности листерий является таксономическим признаком. Некоторые бактерии располагаются по отношению друг к другу в виде римской цифрыили летящей чайки (важный дифференцирующий признак). Культуральные свойства. Листерии - аэробы или факультативные анаэробы. Хорошо развиваются на обычных питательных средах с добавлением 10 сыворотки крови и 1 глюкозы, оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,2-7,4. На МПБВ-0197 образует равномерное помутнение жидкой среды со слизистым осадком, при встряхивании осадок поднимается вверх в виде косички. На МПА мелкие росинчатые с перламутровым оттенком плоские, гладкие, блестящие колонии. На печеночном агаре колонии слизистые. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют в шероховатые -формы. На селективной дифференцально - диагностической средеколонии листерий мелкие сероватозеленые с черным ореолом, через 48 ч колонии становятся зеленоватыми с углубленными центрами,окруженными чрным ореолом. Для культивирования листерий используют также индикаторные и элективные среды. Индикаторные среды среда с ламксом , среда с нейтраль-ротом, среда с конго -ротом, среда с амидо-черным. Селективные среды среда ,среда с теллуритом калия. Листерии обесцвечивают индикаторные питательные среды. Биохимические свойства. Отличительной особенностью листерий является то, что они разлагают с образованием кислоты без газа глюкозу,мальтозу, рамнозу, салицин, трегалозу и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу. Листерии обладают каталазной активностью. Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий. Характерным свойством дляВ-0197 КазНИВИ О-12 является расщепление салицина, этот признак дифференцирует листерии от рожистой бактерии. Листерии не образуют индола и сероводорода, не разжижают желатин, не восстанавливают нитраты в нитриты, выделяют бета-гемолизин. Разлагают перекись водорода с выделением пузырьков кислорода. Антигенная структура. УВ - 0197 КазНИВИ О-12 имеется основной антигенный комплекс О-антиген (соматический) термостабильный. По характеру агглютината. О агглютинация мелкозернистая, клетки соединяются полярными поверхностями,образуя мелкие агрегаты, для О- агглютинации культура берется с верхней части пробирки. На основании общности соматических антигенов листерии объединены в серологические группы,которые обозначены прописными цифрами римского алфавита Н-АВ и О-П, , , , . Современная классификация листерий основывается на их антигенной структуре, делит листерии на основные типы и подтипы. Род листерия подразделен на 4 основных серотипа 1-й, 2-й, 3-й,4-й, при этом четвертый серотип делят на 5 подтипов (а, Ь, с, , е). Внутри группы листерии дифференцируются на основании особенностей О антигенов, при этом 1 серотип содержит О фактор, листерии второго серотипа содержат О-факторы, . ШтаммВ - 0197 КазНИВИ О-12 является эпизоотическим, обладает вирулентными свойствами для крупного рогатого скота, овец и высокой вирулентностью для белых мышей (0,2 см 3 суточной бульонной культуры при подкожном введении гибель белых мышей) вызывает кератоконъюктивит у морских свинок. Штамм листерий обладает абортогенными свойствами, вызывает аборты у овцематок и крупного рогатого скота. За время хранения и при пересевах в лабораторных условиях штамм не изменил культуральноморфологических, биохимических, антигенных свойств, также патогенность, вирулентность. Маркерные признаки штамма В-0197 КазНИВИ. Физиологические прототроф,хемоорганотроф,обладает дыхательным и бродильным типом метаболизма. Аэроб. Не образовывает сероводорода и индола,ферментирует углеводы сообразованием кислоты без газа. При длительном хранении возможна диссоциация из - в - форму, приобретение лекарственной устойчивости. Диссоциация в форму происходит вследствие генетической изменчивости. Вследствие генетических мутаций,под влиянием антибиотиков (тетрациклинового ряда) образуются -формы. Подвижность листерий является таксономическим признаком. Положительная окраска по Граму,коккобактериальная и палочковидная форма клеток,реакция со специфическими агглютинирующими сыворотками, активность каталазы, ферментация каталазы. Доля ГЦ в ДНК штамма составляет 38 мол. Предлагаемый штамм листерий чувствителен к листериозному бактериофагу 2. Серологические. При типизации с диагностическими листериозными агглютинирующими сыворотками агглютинируется поливалентной листериозной и Оагглютинирующей листериозной сывороткой 1 серотипа (О-фактор ). Патогенные свойства. Штамм В - 0197 КазНИВИ О-12 обладает патогенными свойствами для белых мышей массой 16 - 18 граммов, при подкожном введении 0,2 см 3 суточной бульонной культуры, вызывает гибель всех 10 мышей. Штамм обладает патогенными свойствами для морских свинок. При закапывании 2-3 капель суточной бульонной культуры листерий во внутренний угол глаза морским свинкам весом 300-350 г на 2 сутки у животных развивался гнойный кератоконъюктивит. Вирулентность для белых мышей.В - 0197 КазНИВИ О-12 обладает выраженной вирулентностью для белых мышей массой 16-18 граммов, вызывая гибель 100 животных при подкожном введении 0,2 см 3 суточной бульонной культуры на 2-3 сутки. Пример. Питательной средой для получения бакмассы при изготовлении антигена для серологической диагностики сальмонеллезного телят служит бульон Хоттингера (200-250 мг аминного азота), содержащий 10 печеночного экстракта, 0,4 пептона, 10 сыворотки крови крупного рогатого скота и 1 глюкозы. Для приготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера. На 1,0 кг мясного фарша добавляют 15 дм 3 дистиллированной воды,подогретой до 40 С, и подщелачивают 20 раствором едкого натра, так чтобы концентрация водородных ионов была 7,8-8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют 150,0-170,0 г измельченной поджелудочной железы свиньи или 18,0 - 20,0 г панкреатина и на каждый дм 3 смеси -10 см 3 хлороформа. 3 Ферментативное расщепление должно продолжаться 5 -6 сут при 40 -45 С. Химические показатели качественного перевара общий азот 800,0-1200,0 мг аминный азот -500,0-750,0 мг триптофан - 100,0-150,0 мг. Содержание (мг) общего азота определяют методом перегонки Къельдаля аминного азота (мг) - формольным титрованием триптофана (мг)-методом Пешкова. Приготовление печеночного экстракта. На 400,0 г свежей или свежезамороженной печени крупного рогатого скота или свиней, освобожденной от жира и пленок, измельченной на кусочки по 30,0-50,0 г добавляют 5,0 см дистиллированной воды и кипятят в течение часа, после чего фильтруют через ватномарлевый фильтр. Приготовление питательной среды. Для приготовления питательной среды к надосадочной жидкости основного перевара Хоттингера добавляют дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы содержание аминного азота было не менее 200-250 мг. Затем добавляют 10 печеночного экстракта, 0,4 пептона, 3-4 агара. Смесь кипятят в течение 30 минут, затем устанавливают рН среды до 7,7-7,8 путем добавления 20 едкого натра, добавляют 15 дистиллированной воды на выкипание, после чего добавляют 0,3 химически чистого хлорида натрия. После растворения указанных ингредиентов добавлением 20 едкого натра устанавливают рН 7,8-9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1 -1,5 часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для контроля стерильности приготовленную питательную среду засевают на питательные среды МПА, МПБ, МППБ. Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей, рН 7,4 -7,6 и содержать аминный азот 200, 0 -250,0 мг. Приготовление посевного материала. Для изготовления антигена для серологической диагностики сельскохозяйственных животных каждый раз используют отдельную ампулу с лиофилизированной листериозной культурой. Каждый раз проверяют морфологические,культуральные,биохимические свойства и антигенные свойства штаммаВ-0197 КазНИВИ О-12 агглютинировали с поливалентной листерионой и типовой сывороткой 1 серотипа, содержащей О фактор . Бактерии штаммаВ - 0197 КазНИВИ О-12 агглютинируются с поливалентной и типовой О-агглютинирующей листериозной сыворотками. Ампулу с лиофильно высушенной культурой листерий вскрывают и добавляют в нее 2,0 см 3 стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь заливают по 1,0 см 3 в два флакона с бульоном Хоттингера (вместимость флакона 100,0 см 3 , объем среды - 1/3 флакона) с 10 сыворотки крови крупного рогатого скота и 1 глюкозы. Выращивают в термостате 14-15 часов при(культура первой генерации). Культуру первой генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и засевают 50,0 см 3 в бутыль, содержащую 100,0 см 3 бульона Хоттингера с добавлением 10 сыворотки крови крупного рогатого скота и 1 глюкозы (культура второй генерации). Культивирование проводят при(371,0)С 18 -20 часов. Культура второй генерации служит посевным материалом для получения в последующем биомассы. Выращенную и проверенную на чистоту суточную матриксную культуру листерий второй генерации с соблюдением условий стерильности засевают в бутыли со стерильной питательной средой, охлажденной до 37-30 С из расчета 5-10 матриксной расплодки к общему объему питательной среды, одновременно добавляют 0,1(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40 раствора глюкозы 5 -10 и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 1820 часов при(371,0)С. В процессе выращивания культуры через 5-6 часов после засева берут пробу для определения рН, чистоты роста и концентрации микробных тел. Добавляют 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, 1 40 раствора глюкозы и продолжают выращивать еще в течение 4 -6 часов. Пример. Выращенную суточную культуру штаммаВ -0197 КазНИВИ О-12 используют получения антигена для серологической диагностики листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации. Процесс получения антиена включает выращивание -форм листерий на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием,супендированием,ресуспендированием в фосфатно-солевом буфере,стандартизации и инактивации. Использование штаммаВ 0197 КазНИВИ О-12 позволит получить чувствительный и специфичный антиген для серологической диагностики листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерийВ-0197 КазНИВИ депонирован в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт за коллекционным номером О-12 , используемый для приготовления антигена при диагностике листериоза сельскохозяйственных животных в реакции агглютинации.