Мутантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica BKM Y-2785 D – продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты

Данная заявка касается нового штамма Уаггошйа 11 ро 1 уг 1 са И способа получения лимонной КИСЛОТЫ путем ферментации с этим штаммом. Лимонная кислота широко используется в фармацевтической и пищевой промышленности и, как хелатирующий или изолирующий агент, в детергентах и для многих других применений.Современное производство лимонной Кислоты основывается на использовании мутантов гриба АэрегШиз шдег в Качестве сырья в основном используется меласса (свекловичная или тростниковая).Однако меласса, будучи побочным продуктом производства сахара, обычно содержит около 50 ферментируемого сахара, Который может быть превращен в лимонную кислоту другие 50 - это вода(20 ) и органические и неорганические вещества,Которые не могут быть превращены в лимонную кислоту. Таким образом, максимальный выход лимонной КИСЛОТЫ на использованной мелассе не может превышать 30-40 обычно для получения 1 тонны лимонной Кислоты требуется 2,5-3,5 тонны мелассы.Более того, меласса не может быть использована в производстве лимонной Кислоты без предварительной, по Крайней мере, частичной очистки.Другой недостаток заключается в том, что технология получения сахара постоянно совершенствуется, содержание сахара в мелассе соответственно уменьшается и ее качество ухудшается, так как количество неиспользованных веществ возрастает. И поэтому представляется, что глюкоза и глюкозный сироп могут быть использованы в качестве альтернативных сырьевых материалов.Следующий недостаток этого метода - то, что мутанты гриба А 5 рег 311111 шдег имеют тенденцию терять свою активность со временем, даже во время производства.Больше того, как хорошо известно, производство лимонной кислоты методом глубинного культивирования с использованием А. ищет - один из наиболее технически сложных микробиологических процессов.В последние годы дрожжи рассматривались в качестве перспективных продуцентов различных веществ, включая органические кислоты.Обычно используют дрожжи рода Сапсйоа, а именно, СйЬгае, С. 511 Ьггор 1 са 115, С. чиййегшопай, С. 11 ро 1 ут 1 са, С. о 1 еаор 1111 а и С. 2 еу 1 а 11 о 1 с 1 е 5.Эти дрожжи, способные утилизировать различные источники углерода, растут на простой среде и легко растут в ферментерах при методе глубинного культивирования.В различных патентах сообщается об использовании специально селекционированных мутантных штаммов дрожжей для получения лимонной кислоты часто используют дрожжи Уаггошйа 11 ро 1 уг 1 са. Ранее эти дрожжи обозначались как вид Сапойоа 11 ро 1 ут 1 са или асс 11 агошусор 1 11 ро 1 уг 1 са. Фактически,наименования Сапс 11 с 1 а 11 ро 1 уг 1 са, ЗасснагошусорзйзИзвестно, что при культивировании диких штаммов на среде с глюкозой накапливается лимонная кислота со значительной примесью изолимонной кислоты. На среде с н-алканами синтезируются примерно равные количества лимонной кислоты и изолимонной кислот (Финогенова Т.В. и др. Микробиология, 42, М 5, 790, 1973 Лозинов А.Б. и др. Микробиология, 43, М 5, 786, 1974).Таким образом, соотношение продуцируемых кислот в первую очередь определяется природой штамма и используемым источником углерода.Известно, что штаммы Уаггошта 11 ро 1 уг 1 са продуцируют лимонную кислоту при их культивировании на среде, содержащей различные соединения - глюкозу, н-алканы (ПЗ-А-4278764, ОВ-А-1182983, СВ-А-1297 243), ацетат, глицерин, этанол - в качестве источников углерода.Патент Германии (ГДР) М 1313-232309 сообщает о возможности продуцирования лимонной кислоты дрожжами асс 11 агошусор 1 11 ро 1 уйса 181 21 МЕТ 43720 в среде, содержащей вышеуказанные соединения однако никаких примеров или конкретных данных, касающихся осуществления, выхода и т.п. процесса с этанолом в качестве единственного источника углерода не дано.Финогенова Т.В. и др. (Прикл. биохимия и микробиология. 1979, т. 15, вып. 6, 811), обнаружили, что дикий штамм Сашйоа 11 ро 1 уйса 704 и его мутант М 1 способны продуцировать лимонную кислоту при росте на среде с этанолом и дефиците источника азота.Согласно этому документу, способ получения лимонной кислоты включает культивирование дрожжей Сашйоа 11 ро 1 ут 1 са при интенсивной аэрации с ростом продуцента, лимитированным источником азота (аммоний сульфат) в питательной среде, содержащей этанол, минеральные соли, дрожжевой автолизат и микроэлементы рН поддерживается 6.0-7.0.Концентрация лимонной кислоты с использованием мутантного штамма Сашйоа 11 ро 1 уг 1 са М 1 в описанном методе - 4,7 г/л выход относительно добавленного субстрата - 25-30 (вес/вес).Мутантный штамм Сап 11 с 1 а 11 ро 1 ут 1 са М 1, известный как продуцент лимонной кислоты из парафина,при росте на среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, продуцирует лимонную и изолимонную кислоты в концентрации 4,7 и 0,5 г/л, соответственно (Ршоеноуа ет а 1. упь 1 шеш. Зрес. Зушроз. 011 Уеазг, 5. /1, р. 12. МошреШег, Ргапсе,1978 // Финогенова Т.В. и др., 1982. Микробиология,51, вып. 1, 27). Суммарная продукция кислот - 1,9 г на г биомассы.В работе Рйподепоуа ег а 1. (Арр 1/М 1 сгоЬ 1 о 1,В 1 отес 11 но 1., 1991, /. 36, 231-235) авторы нашли, что штаммы Сашйоа 11 ро 1 ут 1 са 704, при их культивировании на среде, содержащей этанол, продуцируют одновременно изолимонную и лимонную кислоты в примерно равных количествах в концентрации до 4050 г/л. В связи с этим, использование штаммов Сашйа5 11 ро 1 ут 1 са Не 1 И Сапсйда 11 ро 1 уг 1 са 704 не позволяет иметь высокие концентрации и выходы одной лимонной кислоты на среде, содержащей этанол.Кроме того, при использовании штамм Сашйда 11 ро 11 т 1 са 704 в качестве микроорганизма-продуцента,производство изолимонной и лимонной кислот в примерно равнь 1 х количествах препятствует возможности рекуперации лимонной кислоты из ферментационной среды. Из этого выходит, что соответствующие промышленные процессы неосуществимы.Теперь мы нашли, что щтамм Уаггош 1 а 11 ро 1 ут 1 са дает высокий выход лимонной кислоты при низком содержании сопутствующих продуктов.Первый объект данного изобретения касается специально селекционированного штамма дрожжей Уаггош 1 а 11 ро 1 ут 1 са, способного накапливать лимонную кислоту, а именно, штамма Уаггоук/а 11 ро 1 ут 1 са НММ 217, депонированного во Всесоюзной (теперь Всероссийской) коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии наук, проспект Науки 5, Пущине,Московская область, 142292, под номером ВКМ У 2785 В 10 июля 1992 года, в соответствии с Будапештским договором о международной регистрации депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.Этот штамм НММ 217 продуцирует лимонную кислоту на множестве различных соединений, как описано в следующей Характеристике штамма.Было также найдено, что этот особый щтамм способен расти на среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода и что он не только хорошо растет на среде с этанолом, но также активно синтезирует лимонную кислоту на этом субстрате.Другой объект изобретения - процесс получения лимонной кислоты, характеризующийся культивированием штамма Уаггошйа 11 ро 1 ут 1 са НММ 217 (ВКМ У-2785 В) при аэробных условиях на питательной среде, содержащей этанол в качестве единственного источника углерода, ионы 2112 и Ре, при дефиците источника азота. В последующем описании и пунктах формулы ссылка сделана на лимонную кислоту, однако надо понимать, что при ферментации, в соответствии с реальным рН процесса, получаются соли лимонной кислоты. Все параметры при этом сообщенные (концентрации, выходы и так далее) относятся к лимонной кислоте.Все типы этанола, полученные химическим синтезом или ферментацией, могут быть использованы в качестве исходного материала.Процесс осуществляется добавлением этанола,непрерывно или периодически, в среду.Наименьшая величина времени процесса, а также наивысшее содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости могут быть достигнуты поддержанием следующих концентраций этанола в начале6 процесса 2,0-2,5 г/л в течение роста биомассы 1,02,0 г/л при продукции кислоты 2,0-5,0 г/л.Действие исходной концентрации этанола в среде на продолжительность лаг-фазы и время начала биосинтеза лимонной кислоты может быть определено из табл. 1.Ферментационная среда содержит следы следующих неорганических элементов К 1, В, 2112, Си,Мн Моб, РеВ течение ферментации поддерживают рН средь 1 в области от 3,2 до 8,0, преимущественно между 3,5 и 7,0, добавляя подходящее неорганическое основание, такое, как гидроксид натрия или гидроксид калия, или карбонат натрия, или карбонат калия и т.п.Действие рН среды, концентрации цинка и железа на продукцию лимонной кислоты дрожжами Уаггошйа 11 ро 1 уг 1 са НММ 217 показано, соответственно, в табл. 2,3,4.Ферментация проводится в условиях перемешивания и аэрации, при которых концентрация кислорода в среде поддерживается в диапазоне от 15 до 100 насыщения, предпочтительно от 50 до 80 нась 1 щения.В процессе культивирования поддерживают температуру 23-35 С, преимущественно 26-30 С.Способ и штамм позволяют достигать концентрации лимонной кислоты 80-130 г/л и выхода 80-100(вес/вес) от количества потребленного этанола в бульоне.Штамм Уаггошйа 11 ро 1 ут 1 са НММ 217 получен обработкой нитрозометилмочевиной Штамма Уаггошта(Саптба) 11 ро 1 ут 1 са 704 и последующей селекцией на агаризованных и жидких средах с этанолом.Штамм изобретения может быть охарактеризован следующим образом.3-суточная культура в жидкой глюкозо-пептонной среде представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,0-6,0 х 4,5-12,5 дм. Небольшие округлые клетки 2,0-2,5 х 3,0-3,5 дм. Почкование полярное или латеральное. Клетки единичные или в цепочках, включающих 3-4 клетки.На вторые сутки роста на жидкой глюкозо-пептонной среде образуются тонкая пленка, кольцо на стенках, тяжелый осадок на дне пробирки.7 культура образует псевдомицелии типа Сапс 11 с 1 а И Мусосанатда.Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Не растет на среде с 50 глюкозы.Не растет при 37 С. Максимальная температура роста 35 С.ПродуЦирует лимонную кислоту на глюкозе,глиЦерине, этаноле, ацетате, алканах, жирах.Однако следует отметить, что штамм Уаггохта 11 ро 1 ут 1 са НММ 217, предложенный в изобретении,отличается от Сапша 11 ро 1 уг 1 са М 1 следующими признакамиРазмер клеток на жидкой глюкозо-пеп 3,2-4,8 х 3,6-10,0 4,0-6,0 х 4,5-12,5Характер роста на жидкой глюкозо-пептонной средеХарактер роста на агаризованной глюкозо-пептонной средеОбразует плотную морщинистую пленкуТаким образом, как указано выше штамм, предлагаемый в данном изобретении, способен расти и продуцировать лимонную кислоту в широком диапазоне рН (3,2-8,0).продуцировать лимонную кислоту в широком диапазоне рН 3,2-8,0. Предлагаемый в данном изобретении способ позволяет значительно повысить концентрацию лимонной кислоты в жидкой культуральной среде - до 130 г/л и выход кислоты от этанола - до 90100 (вес/вес) от массы этанола.Другие преимущества предлагаемого способа1) основное сырье - этанол, полученный химическим путем или ферментацией, который практически полностью переходит в конечный продукт2) продуцентом являются нетоксичные и непатогенные дрожжи Уаггошта 11 ро 1 уг 1 са, которые хорошо растут на этаноле, давая высокую концентрацию и высокий выход конечного продукта от этанола3) при использовании этанола как сырья и дрожжей как продуцента ферментационная жидкость является очень чистой и процесс выделения упрощен4) изолимонная кислота, которая является основным сопродуктом ферментационного процесса,составляет менее 10 от лимонной кислоты.Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ним.Штамм дрожжей Уаггошйа 11 ро 1 ут 1 са НММ 217(номер депонирования ВКМ У-2785 В) поддерживают на косяках сусло-агара с пересевом один раз в два месяца при температуре 28 С. После 3 суток роста клетки с двух косяков переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава (г/л)Дрожжи выращивают на качалке (200 об/мин) при 28 С в течение 24 часов.Через 24 часа проводят второй пересев на среде того же состава, этанол вносят периодически (0,5 исходно и по 0,5 по мере его потребления). Через 26 часов от начала культивирования рН среды поддерживают при 5,0-6,0 10 -нь 1 м ЫаОН. 46-часовую культуру используют для инокулирования ферментера(10 от объема среды в ферментере) и проведения основной ферментации. Ферментацию проводят в 10-литровом ферментере АНКУМ -2 М (Специального конструкторского бюро биологического приборостроения Российской академии наук).Состав среды для ферментации (г/л)Этанол - 16 г (20 мл) на 6 л культуральной средь 1 вносят в среду перед засевом и далее последовательно по мере его потребления.В процессе ферментации температуру поддерживают - 28 С, рН 4.5 доводят 20 ЫаОН, концентрация кислорода - 60 от насыщения.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной КИСЛОТЫ - 130 г/л, изолимонной кислоты 9,5 г/л, выход лимонной кислоты - 90 от внесенного этанола. Лимонную кислоту определяют двумя методами химическим - путем окисления К МЦО, (Жаболовская Н.А. и др. Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 5 22 - 24, 1968) и энзиматическимИзолимонную кислоту определяют энзиматическим методом (Мегнооз оГ епшшайс Гоос 1 апа 1 йз 1 з. Вое 11 гп 1 с 1 ег Мапппейш, 1984, р. 31-32).Ферментацию проводят, как в примере 1, за исключением того, что этанол вносят непрерывно,поддерживая концентрацию 2 г/л, концентрация 2112 в среде - 0,5 мг/л, а рН в течение ферментации поддерживают на уровне 6,0.Через 5 суток ферментации концентрация лимонной кислоты - 103 г/л, концентрация изолимонной кислоты - 9,9 г/л, выход лимонной кислоты - 83 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как в примере 1, за исключением того, что используют дрожжевой экстракт (0,5 г/л) вместо ферментолизата, концентрация 2112 - 0,5 мг/л, в течение ферментации рН поддерживают 6,0. Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 102 г/л, концентрация изолимонной кислоты - 7,0 г/л, выход лимонной кислоты 92 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как в примере 3, за исключением того, что рН во время ферментации поддерживают 3,7.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 107 г/л, концентрация изолимонной кислоты - 5,6 г/л, выход лимонной кислоты 85 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что среда содержит 2112 в количестве 0,1 мг/л.Через 5 суток культивирования среда содержит 50 г/л лимонной кислоты. Выход - 53 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что среда содержит 2112 в количестве 1,94 мг/л и Ре - 1,0 мг/л.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 108 г/л. Выход - 82,5 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что среда содержит 2112 в количестве 0,01 мг/л.Через 5 суток культивирования содержание лимонной кислоты - О.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что среда содержит Ре в количестве 0,01 мг/л.Через 5 суток культивирования содержание лимонной кислоты - 0.3.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что среда содержит 2112 в количестве 0,5 мг/л и Ре - 0.3 мг/л.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 100 г/л, выход - 80 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что в течение ферментации поддерживают рН 3,0.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 1,5 г/л, выход - 3 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что в течение ферментации поддерживают рН 7,0.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 94 г/л, выход - 94 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что в течение ферментации поддерживают концентрацию растворенного кислорода в среде на уровне 40-50 насыщения.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 92 г/л, выход - 63 от внесенного этанола.Ферментацию проводят, как изложено в примере 1, за исключением того, что этанол поддерживают в среде в количестве 1,0 г/л.Через 5 суток культивирования концентрация лимонной кислоты - 102 г/л при выходе - 101,4 от внесенного этанола.Результаты (влияния) условий культивирования на выход лимонной кислоты суммированы в последующих табл. 1-4.