Способ осахаривания крахмалосодержащего сырья для спиртового производства под действием комплекса амилолитических ферментов

(51) 12 3/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ крахмалосодержащего субстрата происходит одновременно под действием композиции ферментов,состоящей из экспериментально подобранного соотношения-амилазы и глюкоамилазы ферментативный гидролиз проводится при низкой температуре оптимальное значение по показателюодинаково для обоих ферментов, составляющих композицию. Композиция составлена из амилолитических ферментов,полученных в процессе микробиологического синтеза штаммов 82 - продуцента -амилазы и- продуцента глюкоамилазы, выделенных из культуральной жидкости с использованием метода микро- и ультрафильтрации. Оптимальным соотношением ферментов-амилазы и глюкоамилазы в композиции является 37. Композиция при таких соотношениях ферментов расщепляет крахмальный субстрат на 98, а конверсия крахмала в глюкозу равняется 81. С использованием МЭК амилаз происходит одновременное разжижение и осахаривание субстрата. Гидролиз происходит при низких температурах и одинаковых значениях величины, при этом из технологического цикла исключается процесс разваривания субстрата и стадии поддержаниядля каждого фермента по отдельности. Использование композиции амилаз при переработке крахмалистого сырья позволяет снизить энергетические затраты и сократить по времени ведение технологического процесса получения этанола.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Сметанкина Ольга Николаевна Коробко Наталья Викторовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ ДЛЯ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА ПОД ДЕЙСТВИЕМ КОМПЛЕКСА АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ(57) Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству этилового спирта. Способ может быть применен на стадиях разжижения и осахаривания крахмалистого сырья в процессе получения этанола, что позволяет снизить вязкость замесов, увеличить степень расщепления крахмала и, как следствие этого, выход целевого продукта. Суть настоящего изобретения заключается в составлении и действии оптимальной композиции амилолитических ферментов,позволяющих осуществить глубокий ферментативный гидролиз углеводов (в частности, крахмала). Особенностью данного изобретения является то,что разжижение и осахаривание Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству этилового спирта. Способ может быть применен на стадиях разжижения и осахаривания крахмалистого сырья в процессе получения этанола, что позволяет снизить вязкость замесов, увеличить степень расщепления крахмала и, как следствие этого, выход целевого продукта. В технологическом процессе получения этанола крахмальный замес смешивается с ферментами и нагревается до температуры, оптимальной для их действия. Под действием разжижающих ферментов(-амилаз) и повышенных температур молекулы крахмала распадаются на низко и среднемолекулярные декстрины и сахара. Полученный раствор охлаждается и в него добавляется осахаривающие ферменты(глюкоамилазы). Осахаривающие ферменты преобразовывают молекулы декстрина в простые сахара, способные перерабатываться дрожжами в этанол. В осахаренное сусло добавляют дрожжи,которые преобразуют молекулы сахаров в этанол и углекислый газ. Процесс брожения длится 72 час. За этот период все доступные сахара сусла перерабатываются в этанол и углекислый газ. Полученная в результате брожения бражка содержит до 10 этанола. Для разжижения крахмала применяются амилолитические препараты,содержащие-амилазу -амилаза гидролизует внутренние альфа 1,4-гликозидные связи крахмала, приводя к быстрому снижению вязкости клейстеризованных растворов крахмала, тем самым обеспечивая подготовку сусла к действию глюкоамилазы. Конечными продуктами действия бактериальной -амилазы на крахмал являются низкомолекулярные растворимые декстрины с небольшим содержанием моно- и дисахаридов (глюкозы и мальтозы). Глюкоамилаза глюкозообразующая амилаза, экзофермент, действует на крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно отщепляя глюкозные остатки. Под их действием крахмал полностью гидролизуется до глюкозы. Ферменты продолжают работать в процессе брожения и проводят догидролиз сусла до получения в конечном итоге 79-86 моносахаридов. Существуют различные способы применения ферментов для разжижения и осахаривания субстрата в технологическом цикле получения этанола. Известен способ производства этилового спирта из крахмалосодержащего сырья, предусматривающий измельчение сырья, смешивание его с водой и препаратом -амилаза при температуре 50-55,проведение тепловой гидродинамической и ферментативной обработки при последовательном повышении температуры от 65 до 105 в течение 3-5 час, охлаждение полученной массы, осахаривание добавлением фермента глюкоамилаза, охлаждение осахаренного сусла с последующим сбраживание и перегонкой образующейся бражки (Технология спирта //В.Л. Яровенко. - М. Колос, Колос-пресс. 2002). В способе производства этилового спирта из зернового сырья авторы (патент 2192469 кл. С 12 Р 7/06, 2002) предлагают введение фермента амилаза из расчета 0,2-0,4 ед. АС/г условного крахмала при температуре 60-70. Затем замес подвергают водно-тепловой и ферментативной обработке при температуре 85-90 в течение 25 - 30 минут, разваренную массу охлаждают, вносят глюкоамилазу из расчета 8,0-9,0 ед. ГлС/г условного крахмала и проводят глубокий ферментативный гидролиз при температуре 55-58 в течение 2-4 часов. В работе Ямашева Т. А., Романовой Н. К (патент 2378381 кл С 12 Р 7/06, 2010) предложен способ,предусматривающий тепловую гидродинамическую и ферментативную обработку, осуществляемую с добавлением фермента амилосубтилин ГЗх из расчета 2,0 ед. АС на 1 г условного крахмала, и ферментов амилолитического действия Термамил СЦ, Шеарзим 500 Лпри температуре 55 С в течение 20 минут. Замес нагревают до температуры 70 и проводят гидродинамическую и ферментативную обработку в течение 90 минут, вторую тепловую обработку проводят при 83 в течение 90 минут, режим стерилизации замеса - 105 в течение 30 минут. Затем разваренную массу охлаждают до 60 и осахаривают ферментным препаратом САН Супер 240 Л . Осахаренное сусло охлаждают и сбраживают промышленным штаммом дрожжейпри температуре 30 в течение 72 ч. Известен способ получения гидролизатов (патент,2113470, кл. 121/18, 1998), когда в крахмалосодержащее сырье вводят воду, нагревают полученную смесь, устанавливаютсмеси 3,0-5,6,выдерживают смесь, изменяютсмеси до 5,8-6,4,вносят амилосубтилин. Осуществляют гидролиз при данноми температуре 80-85, затем гидролизат охлаждают до 55-65, доводятдо 4,5-5,6, вносят глюкаваморин и выдерживают при вышеуказанных параметрах. Недостатком способов являетсяиспользование отдельных ферментов для разжижения и осахаривания субстрата, что способствует увеличению стадий технологического процесса при производстве спиртаводно-тепловая и ферментативная обработка осуществляются при повышенных температурных режимах, что вызывает увеличение энергетических затратустановка различных величинсмеси проводится отдельно для разжижающего и осахаривающего фермента, что также связано с увеличением продолжительности цикла гидролиза,дополнительными экономическими и энергетическими затратами. Наиболее близок к предлагаемому способу является способ комплексной переработки зернового сырья на спирт экзогенными ферментами,предложенный Римаревой Л.В., Оверченко М.Б.(патент 2396007, кл. С 1 А 23 К 1/165, 2010). При этом способе используют ферментативную 2-амилазы,глюкоамилазы, комплекса протеаз, включающего протеиназы и пептидазы, эндо- и экзоглюканаз,ксиланазы. В качестве источника ферментной композиции используют штаммыВУДТ-2 или 1000 У - продуценты глюкоамилазы,ВКПМ -683 или ВКПМ -931 продуценты комплекса протеиназ и пептидаз,-амилазы, эндо- и экзоглюканаз, ксиланазы или технические ферментные препараты. Пшеничный замес нагревают до 60-65 и выдерживают 1 час,затем нагревают до 85-90 и выдерживают еще 1 час. Разжиженную массу охлаждают до 55-58 и подают культуральную жидкость-931, содержащую -амилазу, комплекс протеиназ,пептидаз, в-глюканазу и ксиланазу при дозировке по-амилазе 0,5 ед. АС/г крахмала сырья, по протеазе 1,0 ед. ПС/г крахмала, по ксиланазе - 0,23 ед. КС/г крахмала и по глюканазе - 0,15 ед. - ГкС/г крахмала. Одновременно для осуществления ферментативного гидролиза крахмала сырья вносят культуральную жидкость 1000 - источник глюкоамилазы в дозировке 6,0 ед. ГлС/г крахмала. Процесс осахаривания проводят при температуре 5558 в течение 2 часов. По этому способу в процессе гидролиза используют комплекс ферментных препаратов амилолитического,протеолитического и целлюлазного действия. Недостатком предлагаемого способа является использование композиции ферментов в виде культуральной жидкости,многостадииность процесса и высокая температура на стадиях ферментативного гидролиза. Задачей настоящего изобретения является подбор композиции амилолитических ферментов,позволяющих осуществить глубокий ферментативный гидролиз углеводов (в частности,крахмала), тем самым полнее сбродить сусло до основного продукта - этилового спирта. Отличительным признаком предлагаемого способа гидролиза крахмалосодержащего субстрата является разжижение и осахаривание крахмалосодержащего субстрата идет одновременно под действием композиции ферментов, состоящей из экспериментально подобранного соотношения-амилазы и глюкоамилазыферментативный гидролиз проводится при низкой температуре, что исключает стадию предварительного разваривания сырья при высоких температурахоптимальное значение по показателюодинаково для обоих ферментов, составляющих композицию. Таким образом, использование композиции амилаз при переработке крахмалистого сырья позволяет сократить время процесса и снизить энергетические затраты за счет проведения ферментативного гидролиза при более низкой температуре и единой величиныдля МЭК. Кроме того, стадия разжижения и осахаривания под действием композиции ферментов происходит одновременно. Для решения поставленной задачи в предлагаемом способе, зерновой замес нагревают до температуры 50-55 и вносят комплексный ферментный препарат, содержащий -амилазу в количестве 3 ед./г сырья и глюкоамилазу в количестве 7 ед./г сырья, доводятдо значения 6,5,выдерживают в течение 2 час, полученную массу охлаждают до температуры 30 и сбраживают. Способ осуществляется следующим образом. Амилолитические ферменты, полученные в процессе микробиологического синтеза штаммов 82 - продуцента -амилазы иВУДТ-2 продуцента глюкоамилазы, выделяли из культуральной жидкости с использованием метода микрои ультрафильтрации. Расчет массы каждого компонента для получения МЭК производили по формуле-амилазы глюкоамилазы составляли, исходя из способности ее максимального расщепления субстрата по единицам активности фермента на 1 г сырья, которая опытным путем определена как 3 ед./активности -милазы и 7 ед./ активности глюкоамилазы. Оптимум активности для обоих ферментов составил по показателю- 6,5-6,7, а оптимальные значения температуры 50-55. Это дает возможность исключить из технологического цикла стадии для поддержаниядля каждого фермента по отдельности. Мультиэнзимную композицию амилаз,содержащую -амилазу в количестве 3 ед./г сырья и глюкоамилазу в количестве 7 ед./г сырья вносили в зерновой замес, нагретый до температуры 50-55,выдерживали 2 час, охлаждали до температуры 30 и сбраживали. Процесс осахаривания контролировали по степени гидролиза крахмала и конверсии его в глюкозу. При этом,вследствие проведения низкотемпературного ферментативного гидролиза, из технологического процесса может быть исключена стадия разваривания сырья, происходящего при высокой температуре. Кроме того, так как ферменты имеют один и тот же показатель по , снижаются затраты на его доведение в случае, если ферменты добавляют отдельно на разных стадиях переработки субстрата. Это, в целом, должно способствовать упрощению процесса и снижению энергетических затрат. Сравнительная характеристика процессов при прототипе и предлагаемом способе Стадия технологического процесса Прототип Предлагаемая Измельчение зерна До крупности частиц 0,56-1 мм Охлаждение до 55-58,внесение Внесение осахаривающего фермента, выдержка 2 час композиции ферментов и выдержка при 5055 2 час 72 часа при температуре 30 Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами. Приготовлено несколько образцов композиции, в образце 1 соотношение величин активности соответствует заявляемому, в образцах 2 и 3 отличаются от него. Пример 1 Зерновое сырье, измельченное до крупности частиц 0,56-1 мм, смешивали с водой при температуре 50-55 в соотношении 13. В прогретый пшеничный развар добавляли комплекс ферментов,включающих -амилазу в количестве 3 ед. АС/г крахмала и глюкоамилазу в количестве 7 ед. ГС/г крахмала. Расчет компонентов смеси на 100 г субстрата. Для получения композиции использовали бактериальный препарат из 82 с амилолитической активностью - 4879 ед./г и грибной препарат изВУДТ-2 с глюкоамилазной активностью 5366 ед./г. Количество компонентов, определенное по соответствующей формуле, составило-Амилаза (3 ед./4879)1000,0615 г Глюкоамилаза (7 ед./5366)1000,026 г. В полученной смеси доводилидо 6,5,выдерживали в течение 2 час, остужали до температуры 30 и сбраживали. Степень гидролиза субстрата определяли по остаточному крахмалу и степени конверсии крахмала в глюкозу. Из исходного содержания крахмала в количестве 9,8 остаточный крахмал составил 1,9, а конверсия крахмала в глюкозу произошла на 81 . Пример 2 Мультиэнзимную композицию амилаз -амилазу и глюкоамилазу в соотношении 57 (ед./г сырья), или в расчетном количестве 0,102 г 0,026 г, добавляли в разогретый до 50-55 пшеничный развар, доводилидо 6,5, выдерживали в течение 2 час, остужали до температуры 30 и сбраживали. Степень гидролиза субстрата определяли по остаточному крахмалу и степени конверсии крахмала в глюкозу. Из исходного содержания крахмала в количестве 9,8 остаточный крахмал составил 1,4, а конверсия крахмала в глюкозу произошла на 82,6. Пример 3 Мультиэнзимную композицию амилаз -амилазу и глюкоамилазу в соотношении 17 (ед./г сырья), или в расчетном количестве 0,0204 г 0,026 г, добавляли в разогретый до 50-55 пшеничный развар,доводилидо 6,5, выдерживали в течение 2 час,остужали до температуры 30 и сбраживали. Степень гидролиза субстрата определяли по остаточному крахмалу и степени конверсии крахмала в глюкозу. Из исходного содержания крахмала в количестве 9,8 остаточный крахмал составил 4, а конверсия крахмала в глюкозу произошла на 62. Анализ полученных данных позволяет заключить,что использование МЭК в соотношении ферментов-амилазы и глюкоамилазы 37 является оптимальным, так как большая доза ферментов дает практически тот же эффект при гидролизе субстрата,но невыгодно по затрате большего количества ферментов. Композиции ферментов в меньшей дозе удлиняет процесс за счет более низкого расщепления крахмального субстрата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ осахаривания крахмалосодержащего сырья для спиртового производства под действием комплекса амилолитических ферментов,включающий подготовку и прогрев зернового сырья,подбор композиции амилолитических ферментов,внесение ферментов в приготовленный замес,доведение значения , отличающийся тем, что разжижение и осахаривание субстрата с добавлением комплекса ферментов, включающего -амилазу в количестве 3 ед. АС/г крахмала и глюкоамилазу в количестве 7 ед. ГС/г крахмала, проводят в одну стадию при температуре 50-55 и одинаковых значениях по показателю,исключая предварительную стадию разваривания субстрата при высокой температуре.