Способ получения сухого препарта азотфиксирующих бактерий (нитрагина)

(51)7 05 11/08 КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Саданов Амангельды Курбанович Керимжанова Бахытжан Фазылжановна Жилкин Валерий Станиславович Кенжебаев Вячеслав Эдитович(73) Акционерное общество Институт промышленной биотехнологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПРЕПАРТА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Способ включает культивирование посевного материала в колбах на качалке, инокуляторах, глубинное культивирование в ферментерах, центрифугирование с получением концентрата клеток азот фиксирующих бактерий в виде пасты, поэтапное замораживание пасты нитрагина вместе с защитной средой (содержание сахарозы 20 ), высушивание пасты под вакуумом, измельчение высушенной пасты и смешивание препарата с наполнителем (каолином). Получение сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина) предлагаемым способом позволяет сократить расход материалов и времени,затрачиваемых на производство препарата, увеличить число живых клеток в высушенном препарате,что в конечном итоге повышает эффективность производства сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина). Нитрагинизация семян перед посевом с использованием препарата, полученного предлагаемым способом, повышает урожай бобовых растений в среднем на 23-25 . 17634 Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения азотфиксирующих бактерий (нитрагина). Известен способ изготовления нитрагина путем культивирования клубеньковых бактерий в реакторах на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт (а. с. СССР кл. 05 11/08, 1964). Согласно известному способу бактерии культивируют на кукурузном экстракте, в который вводят дрожжевой экстракт, мел, агар-агар, аммоний сернокислый, гидрокарбонат натрия, затем выращенные бактерии отделяют от питательной среды сепарированием, замораживают с защитной средой и высушивают под вакуумом. Культивирование азотфиксирующих бактерий осуществляют в реакторах в течение 48 ч при плюс 28-30 С в условиях непрерывной аэрации на питательной среде следующего составакукурузный экстракт - 0,5 дрожжевой экстракт - 0,3 агар-агар 0,1 сахар - 1,0 (4)24 - 0,05 4 - 0,02- 0,02 К 2 НРО 4 - 0,05 мел - 0,1 3 - 0,03. Недостатками данного способа являются потребность в дорогостоящих компонентах ферментационной питательной среды и защитной среды высушивания,невысокая эффективность, которая заключается в длительном времени культивирования. Задачей изобретения является повышение эффективности способа получения сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина). Поставленная задача достигается использованием упрощенных питательных сред, позволяющих исключить из их состава дорогостоящие компоненты и сократить время культивирования азотфиксирующих бактерий без снижения их конечного титра. Предлагаемый способ получения сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина) заключается в следующем 1. Выращивание посевного материала в колбах на качалке. 2. Выращивание посевного материала в инокуляторах (содержание бактерий 2,4-5,3 млрд./мл). 3. Культивирование в течение 25 ч в ферментерах с мешалкой. 4. Центрифугирование культуральной жидкости для получения пасты влажностью 80-85. 5. Замораживание пасты азотфиксирующих бактерий (нитрагина) вместе с защитной средой. В качестве защитной среды при сушке используют 44 -ный раствор сахарозы (20 от бактериальной массы). 6. Высушивание пасты в сублимационном сушильном аппарате. 7. Измельчение высушенной пасты. 8. Смешивание препарата с наполнителем (каолином). При наработке посевного материала на колбах используют штаммы азотфиксирующих бактерий из вида , полученные из Института почвоведения г. Алматы (предпатент 7901 МПК С 12 1/20 от 16.08.99). Используют среды, рекомендованные авторами. Состав посевной среды (ПН)2(4)24 0,02 4 72 вода питьевая остальное рН среды 6,75. Операции по культивированию азотфиксирующих бактерий видапроводят в ферментерах с мешалкой. Состав ферментационной средыкукурузный экстракт 0,60 глюкоза 1,00(4)24 0,02 4 72 вода питьевая остальное рН среды 6,85. Питательную среду готовят в ферментере и стерилизуют при температуре 121 С в течение 30 минут. Режим культивирования температура(25-28)С обороты мешалки 450 об/мин расход технологического 50 л/мин воздуха давление в аппарате 0,02-0,04 МПА время культивирования 24-25 часов. Титр клеток должен быть не менее 4,5 млрд. кл/мл (подсчетом в камере Горяева). Культуральную жидкость, полученную после культивирования, центрифугируют при скорости вращения ротора 3000 об/мин в течение 60 мин. После декантации фугата определяют общий вес микробного осадка. Выход пасты с 85 л жидкой культуры составляет в среднем 0,5-0,6 кг (с влажностью 80-85 ). Титр клеток в пасте - не менее 25,0 млрд. кл/г. В качестве защитной среды используют 44 раствор сахарозы. Перед замораживанием в пасту добавляют 20(по массе) раствора сахарозы. Полученную микробную суспензию перемешивают с помощью механической мешалки в течение 30 мин. Отбирают пробу (1 г) на определение титра бактериальных клеток (подсчетом в камере Горяева). Титр клеток до замораживания должен быть не менее 20,0 млрд. кл/г. После добавления защитной среды микробную суспензию разливают в специальные металлические лотки так, чтобы высота слоя не превышала 1-1,5 см. Лотки помещают в низкотемпературные прилавки и замораживают в два этапа до температуры (-17) С в течение 24 ч, затем до (-35) С в течение 24 ч. Высушивание проводят на сублимационной установке. Удаление влаги из материала осуществляют при постепенном повышении его температуры от -35 до 33 С и глубине вакуума - (28-40) Па. Продолжительность сублимационного высушивания препарата составляет в среднем 29 часов. 17634 Остаточная влажность продукта не должна превышать 10 . Титр клеток в 1 г высушенного препарата - не менее 90 млрд. кл./г (подсчетом в камере Горяева). Высушенный препарат из лотков выгружают в фарфоровую ступку и перетирают пестиком до образования однородного порошка. К высушенному,измельченному порошку добавляют расчетное количество наполнителя (каолин) и смесь гомогенизируют. Готовый препарат хранят в герметично укупоренной таре при температуре 4 С. Гектарная порция (200 г) препарата содержит не менее 1200 млрд. клеток. Гарантийный срок хранения сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина) - 7 месяцев. Получение сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина) предлагаемым способом обладает рядом преимуществ по сравнению с действующим в настоящее время производством (нитрагина) (базовым способом). Помимо уже упоминавшейся упрощенной питательной среды, в предлагаемом способе сокращается время ферментации (24-25 ч вместо 48 ч), кроме того, использование методов центрифугирования и поэтапного замораживания микробной биомассы увеличивает выход жизнеспособных клеток после высушивания, что также способствует улучшению технологии получения сухого препарата азотфиксирующих бактерий (нитрагина). Пример 1 Засев колб проводят со скошенной агаризованной среды культурой, в размере одной петли на колбу. Культивируют при 25 С в течение 24 ч на качалке при 220 об/мин. В процессе ферментации измеряют оптическую плотность культуральной жидкости (далее КЖ) и определяют титр клеток по камере Горяева. Посевной материал азотфиксирующих бактерий выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 50 мл посевной среды (ПН) при 28 С на качалке с 220 об/мин в течение 24 ч. Для проведения культивирования готовят стерильный посевной материал в 7-литровых инокуляторах фирмыв объеме 1200 мл азотфиксирующих бактерийшт. А 15 сои с титром клеток 2,4 млрд. кл/мл. Время ферментации - 25 ч. Операция по наработке КЖ азотфиксирующих бактерий- -15 сои проводят в ферментеревместимостью 130 л с мешалкой. Время биосинтеза - 25 ч. Состав ферментационной средыкукурузный экстракт 0,6 глюкоза 1,0(4)24 0,02 4 72 вода питьевая остальное рН среды 6,85. Объем загрузки составляет 85 л. Титр клеток в КЖ - 4,8 млрд. кл/мл. Культуральную жидкость передают на центрифугирование. Титр клеток в пасте составляет 27 млрд. кл/г. Пасту азотфиксирующих бактерий смешивают с защитной средой (44 раствор сахарозы) и передают на замораживание с последующей сублимационной сушкой. Время сушки составляет 26 ч. Высушенный препарат из лотков выгружают в фарфоровую ступку и перетирают пестиком до образования однородного порошка. Отбирают образцы препарата для определения титра бактериальных клеток и содержания остаточной влаги. При сушке по предлагаемому способу остаточная влажность продукта составляет в среднем 3,9 . Общее число клеток в 1 г высушенного препарата составляет 93 млрд. (подсчетом клеток в камере Горяева). Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации составляет 46 млрд. кл/г (методом Пастера). К высушенному измельченному порошку добавляют расчетное количество наполнителя (каолин),смесь гомогенизируют. Пример 2. Засев колб производят со скошенной агаризованной среды культурой, в размере одной петли на колбу. Культивируют при 25 С в течение 24 ч на качалке при 220 об/мин. В процессе ферментации измеряют оптическую плотность КЖ и определяют титр клеток по камере Горяева. Посевной материал азотфиксирующих бактерий выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 50 мл посевной среды (ПН) при 28 С на качалке с 220 об/мин в течение 24 ч. Для проведения культивирования готовят стерильный посевной материал в 7-литровых иннокуляторах фирмыв объеме 1200 мл азотфиксирующих бактерийшт. Д-3 донника ( - Д-3) с титром 5,3 млрд. кл/мл. Время ферментации - 25 ч. Операция по наработке КЖ азотфиксирующих бактерий- Д-3 донника проводят в ферментеревместимостью 130 л с мешалкой. Время биосинтеза - 25 ч. Состав ферментационной средыкукурузный экстракт 0,6 глюкоза 1,0(4)24 0,02 4 72 вода питьевая остальное рН среды 6,85. Объем загрузки составляет 85 л. Титр клеток в культуральной жидкости 7 млрд. кл/мл. Культуральную жидкость передают на центрифугирование. Титр клеток в пасте составляет 56 млрд. кл/г. Пасту азотфиксирующих бактерий смешивают с защитной средой (44 раствор сахарозы) и пере 3 17634 дают на замораживание с последующей сублимационной сушкой. Время сушки составляет 29 ч. Высушенный препарат из лотков выгружают в фарфоровую ступку и перетирают пестиком до образования однородного порошка. Отбирают образцы препарата для определения титра бактериальных клеток и содержания остаточной влаги. При сушке по предлагаемому способу остаточная влажность продукта составляет в среднем 3,4 . Общее число клеток в 1 г высушенного препарата составляет 100 млрд. (подсчетом клеток в камере Горяева). Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации составляет 42 млрд./г (методом Пастера). К высушенному измельченному порошку добавляют расчетное количество наполнителя (каолин) и смесь гомогенизируют. Пример 3. Засев колб производят со скошенной агаризованной среды культурой, в размере одной петли на колбу. Культивируют при 25 С в течение 24 ч на качалке при 220 об/мин. В процессе ферментации измеряют оптическую плотность КЖ и определяют титр клеток по камере Горяева. Посевной материал азотфиксирующих бактерий выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 50 мл посевной среды (ПН) при 28 С на качалке с 220 об/мин в течение 24 ч. Для проведения ферментации готовят стерильный посевной материал в 7-литровых иннокуляторах фирмыв объеме 1200 мл азотфиксирующих бактерийшт. А-17 сои ( - -17) с титром 4,6 млрд. кл/мл. Время ферментации - 25 ч. Операция по наработке культуральной жидкости азотфиксирующих бактерий- -17 сои проводят в ферментеревместимостью 130 л с мешалкой. Время биосинтеза - 25 ч. Состав ферментационной средыкукурузный экстракт 0,6 Глюкоза 1,0 рН среды 6,85. Объем загрузки составляет 85 л. Титр клеток в культуральной жидкости 16 млрд. кл/мл. Культуральную жидкость передают на центрифугирование. Титр клеток в пасте составляет 66 млрд. кл/г. Пасту азотфиксирующих бактерий смешивают с защитной средой (44 сахарозой) и передают на замораживание с последующей сублимационной сушкой. Время сушки составляет 29 ч. Высушенный препарат из лотков выгружают в фарфоровую ступку и перетирают пестиком до образования однородного порошка. Отбирают образцы препарата для определения титра бактериальных клеток и содержания остаточной влаги. При сушке по предлагаемому способу остаточная влажность продукта составляет в среднем 8,86 . Общее число клеток в 1 г высушенного препарата составляет 60 млрд. (подсчетом клеток в камере Горяева). Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации составляет - 34 млрд. кл/г (методом Пастера). К высушенному измельченному порошку добавляют расчтное количество наполнителя (каолин) и смесь гомогенизируют. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения сухого препарата азотфиксирующих бактерий, включающий культивирование микроорганизмов типав условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, в присутствии источников ростовых веществ, концентрирование бактерий из культуральной жидкости с последующей заморозкой, сублимационной сушкой и усреднения титра клеток, смешивание препарата с наполнителем, отличающийся тем, что культивирование осуществляют на упрощенной питательной среде,время биосинтеза азотфиксирующих бактерий сокращают до 21-25 ч, центрифугируют, замораживают двуступенчато микробную массу, в качестве защитной среды перед сублимационной сушкой вводят 44 -й раствор сахарозы.