Продуцент внеклеточного поверхностно-активного вещества

(73) Внедренческое Малое предприятие (ВМП)(57) Изобретение относится К биотехнологии и касается применения дрожжей для получения поверхностноактивного вещества (ПАВ) микробного происхождения. Сущность изобретения заключается в примененииИзвестен продуцент штамм дрожжей РЬаПЪа гЬобо 1 ута у-2274 клетки и купьтурапьная жидкость которого способны эмупьгировать различные углеводороды.Однако, для регуляции синтеза биоэмупьгатора необходимо добавление в среду цитрата натрия(Кучер Р.В. Лесык О.Ю., Елисеев С.А. Карпенко 8., Туровскттй А.А. Випьданова-Марцишин Р.И. Полупях О.В. Эмупьгироваттие углеводородов новое свойство культуры дрожжей РЬаШа гтосдо 1 утпа / Докл. АН УССР. Б.-1990-.- Не 8.- с.5-54)./Известен продуцент - штамм Салсдоа тгорбсайз,образующий при росте на гексадене вещество,обладающее свойствами эмупьгатора.Однако продукт эффективен только в качестве стабилизатора эмульсий (Еп 9 Ь Магйеет. Байт /..,АбЫкагб ЦК, Везай 1.0., 51510 УЛ. Ргодистйоп о ЫоептиЫПег Ьуа БСР-ргооисбпб 1 гооЕп о Сапбоапродуцирования поверхностно-активного вещества на бедной синтетической среде без факторов роста с эталоном в качестве единственного источника углерода. Препарат получают путем лиофильного высушивания культурной жидкости. Его поверхностно-активные свойства проявляются в снижении поверхностного натяжения воды с 72,75 МН/М д 048,49 МН/М и диспергировании гидрофобной фазы (различные виды нефти и жир).ПРИМЗНСНИС штамма СООТВЕТСТВУЕТ ТрСбОВЗНИЯМ охраны ОКРУЖЗЮЩСЙ среды.Наиболее близким является штамм дрожжей который продуцирует липо 3 ан сравнимый по стабилизирующим свойствам с коммерческими синтетическими образцами.Однако этот эмульгатор продуцируется только при росте на полноценной среде с предельными углеводородами, дрожжевым экстрактом в качестве фактора роста или с добавлением мелассы и мочевины. На средах с растворимыми субстратами (ацетат. глюкоза) эмульгируютцвя активность практически отсутствует (Сбгбфйапо М.С.,Сагтап 6.М. РитЭЬЕсаНоп апс Слагастегйайоп о Провал , а ВЕоетиЫЕег Тгот СапсМа Прыу-Нксо.Штамм СапсНсЗа кгизей 40 (ИМиВ У-1) был выделен методом селекции при иммобилизации на протоке в лабораторных условиях. идентифицирован на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ и рекомендован дляполучения белковой биомассы на синтетических средах с этиловым спиртом без факторов роста.Решают задачу получения более дешевого поверхностно-активного вещества ПАВ) путем культивирования штамма дрожжей СалсНоа кгизей- 40 ИМиВ У-1 на бедной минеральной среде с эталоном в качестве единственного источника углерода без добавления факторов роста как продуцента ПАВ.Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем. Дрожжи выращивают на косяках сусло-агара до 24 часов, затем пересевают на жидкую синтетическую среду, в состав которой входят ( в г/л ) МаМОЭ - 1,0 КН 2 РО 4 - 1,0 М 904-05 КС 1-0,5 этанол -10. Выращивают дрожжи в колбах Эрленмейера на качалке при режиме 200 об/мин. и температуре 30 С. Биомассу трехсуточной культуры отделяют центрифигированием при 8 тыс. об / мин. в течение 20 мин. Культуральную жидкость лиофилизируют,получая сухой неочищенный препарат поверхностно-активного вещества и определяют эмульгирующую активность раствора соответствующей концентрации по изменению оптической плотности после взаимодействия с гидрофобной фазой. Выход продукта составляет 2-3 г на литр культуральной жидкости с клеточной массой 2,6-2,9 г/л в пересчете на сухой вес.Сравнение исходной 2-3-х суточной культуральной жидкости используемого штамма Салйоа кгизей 40 (0,15-0,64 ед.эмульгирующей активности) с аналогичной прототипа (0,190,52 ед.) говорит о сопоставимости внеклеточных эмульгаторов. Однаковыделение зарубежного липозана и отечественных аналогов осуществляют экстракцией метанопом или эфиром, тогда как применение штамма Салойоа кгизей 40 позволяет использовать просто высушенную культуральную жидкость, а по стабилизирующим свойствам препарат предлагаемого продуцента не уступает препарату прототипа.В 1993 г. этот штамм был депонирован в качестве продуцента ПАВ в Институте микробиологии и вирусологии Национальной Академии Наук Республики Казахстан под номером ИМиВ У-1. Справка о депонировании прилагается.Штамм Сапойа кгизей 40 характеризуется следующими свойствами.Рост в жидком сусле через 3 суток клетки овальные, удлиненно-цилиндрические (1,5-6,2) х(37-120) мкм, есть псевдогифы, клетки которых достигают 30-40 мкм. Почкование многостороннее, голобластическое. На поверхности среды образуется сухая пленка,всползающая на стенки пробирки. На сусло-агаре штрих белый, слегка кремоватый, тусклый, смучнистой присыпкой и мицелиальным краем. Гигантская колония на суслоагаре распростертая,белая, тусклая, с широколопастными краями и ворсинчатым обрамлением за счет роста псевдомицелия. На пластинках кукурузного агара обильно развивается разветвленный псевдомицелий из длинных клеток с пучками крупных овальных бластоспор. Аскопоры не образуется ни на одной из ассимиляционных сред.Сбраживает только глюкозу. Брожжение при 28 С проявляется на 2 сутки. Штамм усваивает глицерин, этанол, молочную, янтарную и яблочную кислоты. Нитраты не утилизирует. В среде без витаминов растет. Температура роста при 5 не растет, при 43 есть рост. Крахмалоподобных веществ не образует.Урезанный и ДНК-азный тесты отрицательны. Проявляет чувствительность к циклогексимиду рост подавляется при концентрации 0,1.Максимальная концентрация усваиваемого этанола составляет 100 г/п.При росте СапсНсТа кгизей 40 на этанол в среду культивирования выделяются экзометабопиты,обладающие свойствами ПАВ. Они проявляются в снижении поверхностного натяжения воды,диспергировании гидрофобного компонента и стабилизации полученной эмульсии типа масло в воде.Штамм поддерживают периодическими пересевами на косяки СА. Культуру хранят на косяках СА под вазепиновым маслом.Штамм Сапобоа кшзей 40 нетоксичен и непатогенен.Пример 1. Снижение поверхностного натяжения воды исследуют методом втягивающейся пластинки(метод Вильгельми), используя тензиометр ДюНуи. Поверхностное натяжение растворов различной концентрации неочищенного препарата определяют при температуре 20 С в течение 60 минут. Значения поверхностного натяжения воды в присутствии ПАВ представлены в таблице 1.По данным таблицы 1 видно, что полученный внеклеточный биополимер проявляет свойства ПАВ, снижая поверхностное натяжение воды с 72,75 мН/м до 48,49 мН/м, причем уменьшение содержания вещества в 4 раза существенно не влияет на значение этого параметра.Пример 2. Для эмульгирования используют нефть 3 видов 1 - содержит до 20 парафинов,смол и асфальтенов 2- беспарафинистая с преобладанием нафтено-ароматических соединений 3 - содержит углеводороды смещенного типа. Эмульгирующую активность определяли при различных значениях рН среды. В колбу Эрленмейера помещают 40 мг нефти, 5 мл буфера, содержащего около 0,5 двухвалентных ионов и 50 мкг/мл лиофильно высушенной культуральной жидкости штамма С.Кгизей (неочищенный эмульгатор). Контрольная колба - реакционная смесь без эмульгатора. Пробы встряхивают на качалке при режиме 320 об/мин., 1 30 С в течение 2 часов.После 10-минутного отсаивания содержимое колбы помещают в кювету и измеряют мутность суспензии на колориметре при длине волны 600 нм.Пример 3. В колбу Эрпенмейера помещают 5 мл буфера, 02 мл маргарина и 100 мг эмульгатора. Реакционную смесь встряхивают на качалке при режиме 320 об/мин., 1 30 С в течение 2 часов. После 10 - минутного отстаивания измеряют мутность суспензии при длине волны 600 нм.Данные по двум примерам представлены в таблице 2.По данным таблицы 2 видно, что в присутствии эмупьгатора диспергируются все исследуемыепипофипьные компоненты смесей. Однако,навысшие значения эмульгирующей активности проявляются в щелочной среде для нефти 2 и З, а также маргарина, что предполагает специфичность данного эмульгатора.Образование эмульсий типа масло в воде с различными углеводородами указывает на эффективность действия биоэмульгатора С. Кгизей 40 и перспективность использования его для очистки резервуаров от нефти, промышленных емкостей маргаринового производства. Применение биоэмульгатора возможно также в медицине, парфюмерии, лакокрасочном производстве.Применение штамма дрожжей Сапбкда Кгцзей 40 ИМиВ У-1 вкачестве продуцента внеклеточного поверхностно-активного вещества.Поверхностное натяжение воды при различных концентрациях внеклеточного ПАВ штамма Сапсйба кгшей 40 ИМиВ У 0,25 58,57Значения удельной эмупьгирующей активности биоэмульгатора (в ед. Клетта) дрожжей С. Кпйзей 40 ИМиВ У- в суспензиях с различными гидрофобными компонентами при изменении рН средыВерстка Казпатент Ответственный за выпуск Э.3. Фаизова