Штамм streptomyces roseoflavus var. roseofungini 1128 и его проактиномицетоподобный вариант 1-68-продуценты полиенового антибиотика розефунгин, обладающего противогрибковой и антивирусной активностью

(51) 61 35/74 (2006.01) 12 1/465 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ спектра грибковых инфекций человека и животных,а также вирусов человека и животных. Сущность изобретения для получения высокоактивных продуцентов антибиотика розеофунгин отобран штамм.1128 и селекционирован его проактиномицетоподобный фруктозный вариант.168, а также подобраны условия культивирования,позволяющие достигнуть высокого выхола полиенового антибиотика розеофунгин,обладающего одновременно противогрибковой и антивирусной активностью,Положительный эффект преимущества предлагаемых штаммов перед существующими заключаются в том, что они являются продуцентами антибиотика розеофунгин,эффективного в отношении различных возбудителей грибковых инфекций человека и животных, а также различных вирусов человека и животных. Предлагаемые штаммы позволяют получать высокоактивный и малотоксичный антибиотик розеофунгин с высоким выходом конечного продукта и могут быть использованы для производства антибиотика розеофунгин в промышленных масштабах.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Березин Владимир Элеазарович Треножникова Людмила Петровна Балгимбаева Ася Султановна Шакиев Серик Шакиевич Хасенова Алмагуль Хамитовна Айткельдиева Светлана Айткельдиевна.1128 И ЕГО ПРОАКТИНОМИЦЕТОПОДОБНЫЙ ВАРИАНТ 1-68-ПРОДУЦЕНТЫ ПОЛИЕНОВОГО АНТИБИОТИКА РОЗЕФУНГИН,ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ И АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(57) Использование медицина и ветеринария, в частности, микробиология и вирусология, а именно производство и применение новых противогрибковых и противовирусных препаратов. Цель получение высокоактивных штаммовпродуцентов полиенового антибиотика розеофунгин. эффективного в отношении широкого Изобретение относится к области получения антибиотиков, используемых в медицине и ветеринарии для лечения поверхностных и глубоких микозов, а также вирусных инфекций. Во всем мире отмечается рост заболеваний,вызываемых дерматомицетами, дрожжеподобными и плесневыми грибами. Грибковые поражения отличаются большой вредоносностью и разнообразием локализации. Описаны грибковые поражения центральной нервной системы, больших полушарий мозга, мозжечка, легких, желудочнокишечного тракта, костной системы, кровяного русла, кожи и ее придатков. Заболеваемость в Казахстане составляет 9-11 тысяч на 100 тысяч человек (данные Казахского кожно-венерологического института). Особенно подвержены грибковым инфекциям густонаселенные районы с теплым климатом,солдаты срочной службы. Для микозов характерно длительное рецидивирующее течение. Большую проблему дерматомикозы представляют и для ветеринарии. Существующие лекарственные противогрибковые препараты не всегда эффективны, требуют длительного применения,иногда в течение нескольких месяцев. Это способствует возникновению устойчивых форм возбудителей, вызывает необходимость увеличения лечебных доз, что усиливает вредное побочное действие препаратов и влечет значительные материальные затраты. В связи с этим актуален поиск новых более эффективных средств для лечения микозов. Необходимость поиска противовирусных средств также не вызывает сомнений в связи с высокой изменчивостью вирусных штаммов и возникновением у них устойчивости к лекарственным препаратам. Вследствие этого,существующие лекарственные средства быстро теряют эффективность при лечении вирусных инфекций. Кроме того, во многих случаях необходимо сочетание различных видов противомикробной и противовирусной активности для лечения ряда заболеваний, особенно у лиц с иммунодефицитным состоянием(при ВИЧ инфекции,герпесе,при врожденных и приобретенных системных иммунодефицитах и т.д.). Таким образом, поиск новых противогрибковых и противовирусных препаратов широкого спектра действия представляет собой весьма актуальную проблему. Одним из путей решения данной проблемы является получение антибиотика,обладающего одновременно противогрибковой и противовирусной активностью. Для получения и производства подобного антибиотика необходим высокоактивный продуцент,обладающий способностью синтезировать необходимый компонент с противогрибковой и антивирусной активностью, а также имеющий высокую продуктивность с хорошим выходом целевого продукта. 2 Известен штамм,продуцирующий противогрибковый полиеновый антибиотик леворин, активный в отношении дрожжеподобных грибов родаи некоторых простейших ( ) ( ,.1997 . 24 .235-47). Недостатком продуцируемого им антибиотика является высокая токсичность и отсутствие антивирусной активности. Известен штамм продуцирующий полиеновый противогрибковый антибиотик Амфотерицин В,оказывающий фунгицидное действие или фунгистатическое действие на грибы родов ,( ,.30.1990 . 12,.308-29). Недостатком продуцируемогоантибиотика является высокая токсичность и низкая активность в отношении многих возбудителей грибковых инфекций. Данный антибиотик не обладает противовирусной активностью. Известен штамм 476, продуцент противогрибкового антибиотика А 23/791,который подавляет рост многих фитопатогенных грибов,дерматофитов и дрожжеподобных грибов и обладает способностью стимулировать рост и развитие растений(Никитина Е.Т., Каркинбаева А.К., Ветлугина Л.А. и др. Штамм 4-76 продуцент антибиотика А-23/791. А.с. 744033 от 07.03.1980). Недостатком антибиотика продуцируемого данным штаммом является низкая эффективность в отношении возбудителей грибковых инфекций человека и животных и отсутствие противовирусной активности. Данный штамм является наиболее близким аналогом к заявляемому продуценту. Таким образом,известные штаммы актиномицетов продуцируют полиеновые антибиотики, которые являются недостаточно эффективными в отношении возбудителей грибковых инфекций человека и животных, часто оказываются токсичными, избирательно действуют на определенные виды возбудителей и не обладают противовирусной активностью. Целью изобретения является получение высокоактивных продуцентов нового полиенового антибиотика,Розеофунгин,обладающего одновременно противогрибковой и антивирусной активностью. Сущность изобретения заключается в подборе высокоактивных штаммов продуцентов нового полиенового антибиотика розеофунгин и отработке условий их культивирования,позволяющих достигнуть высокого выхода целевого продукта. Установлено наличие способности продуцировать новый полиеновый антибиотик розеофунгин у штамма.1128 и его проактиномицетоподобного варианта 1-68. Штамм.1128 выделен из темно-каштановой почвы, ризосферы моркови Алма-Атинской области. Оба штамма депонированы в коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОН РК штамм.1128 - коллекционный номер ИМиВ Ас-2 и его проактиномицетоподобный фруктозный вариант.штамм 1-68- коллекционный номер ИМиВ Ас-3. Показано, что продуцент.шт. 1128 синтезируют антибиотик розеофунгин, обладающий противогрибковой и антивирусной активностью. В частности,установлена высокая активность антибиотика розеофунгин при подавлении роста возбудителей поверхностных и глубоких микозов человека и животных - трихофитии, микроспории, кандидозов,криптококкоза, хромомикоза, аспергиллеза и др. Также установлена высокая вирусингибирующая активность антибиотика розеофунгин по отношению к различным штаммам вируса гриппа,парамиксовируса Сендай и вируса болезни Ньюкасла. Путем изменения условий культивирования из штамма.1128 получен его проактиномицетоподобный вариант.1-68. Показана высокая противогрибковая активность и противовирусная активность антибиотика розеофунгин,продуцируемого обоими штаммами. Также установлена низкая токсичность антибиотика розеофунгин в опытах на животных. Сущность изобретения поясняется наследующих примерах Пример 1. Культурально-морфологические свойства продуцента штамм.1128 растет при 28-30 С, рН естественный. На диагностических средах (СР-1 Красильникова, Гаузе-1, Газе-2, Чапека) образует мучнистый или бархатистый воздушный мицелий от белого до розового и розово-желтого, цвет субстратного мицелия желтый или желтоватобуроватый. Споры в цепочках. Спороносцы спиральные с 3-5 оборотами. Форма спор и характер выростов оболочки спор под электронным микроскопом - продолговатые, овальные, гладкие. Физиологические свойства аэроб, хорошо ассимилирует глюкозу, Д-ксилозу, -арабинозу, Дманнит, Д-фруктозу, сахарозу, хуже -инозит, Драмнозу, Д-раффинозу. По культурально-морфологическим признакам виду 4-76. Но на основании иной антимикробной активности,проявляющейся в способности образовывать противогрибковый антибиотик розеофунгин,отличающийся от антибиотика А-23/791, а также физиологических отличий (энергичный гидролиз крахмала, инверсия сахарозы, хорошее усвоение лактозы, особенности роста на среде с фруктозой,отсутствие способности усваивать целлюлозу,раффинозу и рамнозу) изученный штамм отнесен к разновидности этого вида. Пример 2. В связи со способностью продуцента.1128 образовывать антибиотик розеофунгин с разной степенью интенсивности в зависимости от состава питательной среды определяют активность продукта на трех средах синтетической Чапека (глицерин 10,0, К 2 НРО 4 - 1,0, О 3 - 1,0, 4 - 0,5,С - 0,5, вода водопроводная -1 л) и двух органических средах с рыбной мукой 1272- 5,0, лактоза - 20,0, мел - 5,0, (4)2 4 - 5,0,крахмал - 10,0). В качестве посевного материала применяют двухсуточную культуру продуцента на кукурузной среде следующего состава кукурузный экстракт 10,0, крахмал -15,0, глюкоза - 10,0. мел - 5,0,(4)2 4 - 5,0, вода водопроводная - 1 л. Продуцент культивируют глубинным методом в течение 10 дней. Антибиотическое вещество накапливается в основном в мицелии, поэтому в конце ферментации мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием и используют для экстракции антибиотика. Антибиотическую активность культуральных жидкостей и экстрактов определяют методом серийных разведений в отношении гриба. Результаты определения показывают, что процесс развития культуры.1128 носит двухфазный характер. Установлено, что наиболее благоприятные условия для роста и развития продуцента розеофунгина создаются при его культивировании на органической среде с рыбной мукой (1272-51). Культура развивается быстрее, время первой фазы сокращается до 72 часов, что вызывает интенсивное и в большом количестве накопление антибиотика. Максимальный количественный выход антибиотика получен на среде 1272-51 при культивировании в течение 96-120 час. Пример 3. Для выявления значимости компонентов среды для биосинтеза антибиотика составлено 32 варианта среды 1272-51 (табл.1). Наиболее высокий выход антибиотика (1240.6 ед/мл) достигнут на среде 31. Установлено, что уровень накопления антибиотика в мицелии продуцента зависит от 3 концентрации глюкозы и лактозы. С использованием математической обработки рассчитано влияние каждого компонента питательной среды на выход антибиотика розеофунгина и накопления биомассы (табл.2,3). Из данных табл. 2 видно, что наиболее значительный положительный эффект на выход антибиотика оказывают крахмал, лактоза и глюкоза. Отрицательно на выход антибиотика влияют дефицит крахмала мела, пептона, а также избыток глюкозы. Более значимым в биосинтезе розеофунгина является органический азот по сравнению с минеральным. Для накопления биомассы продуцента розеофунгина наиболее значимым компонентом является крахмал (табл.3). На основе расчета эффектов составлена оптимизированная среда для образования антибиотика продуцентом.1128 (рыбная мука - 1,0, пептон 1,0,- ,06, глюкоза - 2,0, лактоза - 2,0, (4)2 4 - 0,2 СаСО 3 - 0,5, крахмал - 1,0). Пример 4 Проактиномицетоподобный фруктозный вариант.168 получен на среде Придхэма-Готтлиба с Дфруктозой, в результате вторичного роста.1128. Вторичные колонии ..появляются в конце первой - начале второй недели роста. Их массовое образование отмечается на третьей-четвертой неделе. В отличие от кожистых розовых исходных колоний, вторичные колонии не имеют воздушного мицелия, обладают иной окраской (желтая, реже зеленая, оранжевая, красная или черная), имеют мягкую консистенцию. При микроскопическом исследовании обнаруживается усиленная фрагментация и распад гиф мицелия. Продуцент антибиотика розеофунгин выращивают в две стадии (посевная и собственно ферментационная) на питательной среде следующего состава (г.литр) глюкоза -20,0 лактоза-20,0 (4)24-2,0 С-5,0 овсяная мука-30,0 вода водопроводная -1 литр рН-естественный. При посеве проактиномицетоподобной культуры.1-68 в ферментационную среду через 3 часа на концах членистых фрагментов гиф, взятых с плотной среды,появляются базофильные вздутия и растущие участки, которые к 7 часам превращаются в высокобазофильные,гомогенные,с редко расположенными перерывами длинные гифы, не отличающиеся в этот период от обычных актиномицетных гиф. После 120 часов выращивания проактиномицетной культуры 1-68 наступает автолиз, наблюдается вторичный рост мицелия из фрагментов,образовавшихся при распаде первичного мицелия. Полученный таким образом из продуцента антибиотика розеофунгина шт. 1128 проактиномицетоподобный фруктозный вариант.1-68 по активности продукции антибиотика розеофунгин в 6-8 превышает исходный штамм.1128. Полученный с использованием проактиномицетоподобного варианта.168 антибиотик розеофунгин.1-68 заключаются в том, что они являются продуцентами антибиотика розеофунгин, обладающего высокой противогрибкой и противовирусной активностью, а также низкой токсичностью. Продуценты.1128 и.1-68 могут быть использованы в промышленном производстве антибиотика розеофунгин,обладающего противогрибковой и антивирусной активностью. Таблица 1 Накопление биомассы продуцента и антибиотика розеофунгин на средах с различной концентрацией компонентов. Вариант сред Рыбная Пентон мука Выход анти биотика ед/мл 527,8 930,5 751,5 1206,0 656,4 583,5 903,6 555,4 1004,0 1091,7 755,3 1014,6 638,2 Вариант сред Рыбная Пентон мука Выход анти биотика ед/мл 690,2 957,3 679,9 1047,2 1156,2 768,4 336,5 552,2 610,7 391,8 1011,8 711,7 819,2 376,5 594,1 946,6 752,3 1240,6 664,2 Таблица 2 Влияние концентрации компонентов в питательной среде на выход антибиотика розеофунгина Компонент, Рыбная мука Эффект Пептон Эффект Глюкоза Эффект Лактоза Эффект Влияние концентрации компонентов в питательной среде на накопление биомассы Компонент, Рыбная мука Эффект Пептон Эффект Глюкоза Эффект Лактоза Эффект(4)24 Эффект СаСОЗ Эффект Крахмал Эффект ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм.1128 (коллекционный номер - ИМиВ Ас-2) и его проактиномицетоподобный фруктозный вариант.штамм 1-68 продуцентами полиенового антибиотика,обладающие способностью продуцировать новый полиеновый антибиотик розеофунгин,высокоактивный в отношении широкого спектра возбудителей грибковых инфекций человека и животных, а также вирусов человека и животных.