Способ получения антибиотика розеофунгин, обладающего противогрибковой и антивирусной активностью

(51) 61 35/66 (2006.01) 61 31/10 (2006.01) 61 31/12 (2006.01) 12 1/465 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ.1-68 культивирование которого осуществляют на питательной среде, содержащей в качестве основного источника углерода овсяную муку в количестве 30 г/л, экстракцию антибиотика из биомассы производят с помощью 96 этилового спирта в соотношении мицелийэтанол 15 в течение 2 часов при комнатной температуре, полученный экстракт упаривают в вакууме при температуре 3540 С, к водному остатку добавляют 5-кратное количество дистиллированной воды,образовавшийся осадок отфильтровывают и высушивают под вакуумом. Преимущество изобретения заключается в создании простой и эффективной производственной технологии получения лекарственного средства,сочетающего высокую противогрибковую и антивирусную активность, низкую токсичность широкий спектр действия против возбудителей грибковых и вирусных инфекций. Предлагаемый способ получения лечебного средства с противогрибковой и антивирусной активностью может быть использован для производства антибиотика розеофунгин в промышленных масштабах.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Березин Владимир Элеазарович Треножникова Людмила Петровна Балгимбаева Ася Султановна Шакиев Серик Шакиевич Хасенова Алмагуль Хамитовна Богоявленский Андрей Павлинович Айткельдиева Светлана Айткельдиевна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА РОЗЕОФУНГИН,ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОГРИБКОВОЙ И АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(57) Использование медицина и ветеринария, в частности, микробиология и вирусология, а именно производство и применение новых противогрибковых и противовирусных препаратов Цель разработка эффективной технологии получения полиенового антибиотика розеофунгин,обладающего одновременно противогрибковой и антивирусной активностью, которая могла бы использоваться при производстве данного лечебного препарата. Сущность изобретения для получения антибиотика розеофунгин используют продуцент Изобретение относится к фармбиотехнологиям, в частности к технологии получения антибиотиков,используемых в медицине и ветеринарии для лечения поверхностных и глубоких микозов, а также вирусных инфекций. Грибковые заболевания, или микозы относятся к инфекционным болезням, составляя значительную их часть. По различным экспертным оценкам,распространенность микозов охватывает 10-20 взрослого населения и значительно возрастает в старших возрастных группах. В возрасте 70 и более лет этим недугом страдает уже 50 населения. Наблюдается быстрый рост микозов по всем возрастным группам населения. Так, по данным эпидемиологических исследований микозы выявляются уже у 28 пациентов молодого и среднего возраста. В последние годы отмечается тенденция к увеличению заболеваемости микозами не только у взрослых, но и у детей. Грибковые поражения отличаются большой вредоносностью и разнообразием локализации. Описаны грибковые поражения центральной нервной системы, больших полушарий мозга, мозжечка, легких, желудочнокишечного тракта, костной системы, кровяного русла, кожи и ее придатков. Имеющиеся на рынке лекарственные противогрибковые препараты не всегда эффективны, требуют длительного применения,иногда в течение нескольких месяцев. Это способствует возникновению устойчивых форм возбудителей, что в свою очередь вызывает необходимость увеличения лечебных доз. Последнее усиливает вредное побочное действие препаратов и влечет значительные материальные затраты. Поэтому, создание и производство новых лекарственных препаратов, направленных на лечение микозов, является весьма актуальной задачей, имеющей большое практическое значение. Не меньшую актуальность имеет разработка новых противовирусных средств. В настоящее время для лечения вирусных инфекций используется более 100 различных препаратов,которые являются модификациями весьма ограниченного (не более 12) числа биологически активных соединений. Из-за чрезвычайно высокой изменчивости возбудителей многих вирусных инфекций, у вирусов быстро развивается адаптация к применяющимся лекарственным средствам, что требует поиска новых более эффективных препаратов. Кроме того, во многих случаях для лечения ряда заболеваний, в том числе оппортунистических инфекций при иммунодефицитных состояниях, а также при противоопухолевой терапии, необходимо сочетание различных видов противомикробной и противовирусной активности. Возрастание в популяции лиц с иммунодефицитными состояниями врожденного или приобретенного характера (СПИД,атопические состояния,длительный прием кортикостероидов или иммуносупрессивных препаратов) приводит к необходимости проведения сочетанной антимикотической и антивирусной терапии. Это требует создания новых лечебных 2 препаратов,обладающих одновременно противогрибковой и антивирусной активностью. Одним из немногих препаратов, обладающих сочетанным антимикотическим и антивирусным действием, является новый полиеновый антибиотик Розеофунгин(Лечебное средство с противогрибковой и антивирусной активностью,Инновационный патент РК 25633 от 27.03.2012). Для производства антибиотика Розеофунгин требуется эффективная технология его получения и очистки. Технология производства антибиотика включает ряд основных этапов, связанных с наработкой биомассы продуцента, выделением антибиотика и его химической очисткой. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика Нистатин. Данный антибиотик продуцируется микроорганизмом. Для получения антибиотика продуцент высевают на кукурузно-глюкозную питательную среду,содержащую не менее 4 углерода и 40-60 мг фосфора. Из образовавшейся мицеллиальной массы производят экстракцию антибиотика органическим растворителем, в качестве которого используют метиловый спирт. Для удаления органического растворителя производят отгонку в ротационном испарителе. После отгонки препарат промывают и высушивают под вакуумом (Способ производства противогрибкового антибиотика - нистатина. А. с. СССР 136856 от 04.08.1978). Недостатками данной технологии является использование дорогостоящей кукурузно-глюкозной среды для культивирования продуцента,применение высокотоксичного органического растворителя для экстракции антибиотика. Кроме того, получаемый антибиотик неэффективен против многих грибковых инфекций и не обладает антивирусной активностью. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика леворин,продуцируемого культурой. Данный антибиотик активен в отношении дрожжеподобных грибов родаи некоторых простейших ( ) ( ,.1997 . 24 .235-47). Для получения антибиотика продуцент высевают на ферментационную среду без твердых остатков,содержащую в качестве источников углеводов глюкозу и крахмал, в качестве источников азота сернокислый аммоний и кукурузный экстракт. Антибиотик получают путем экстракции мицелия продуцента органическим растворителем. В качестве органических растворителей используется метиловый спирт или диметилформамид. После экстракции органический растворитель удаляют методам ротационного испарения (,Патент США 3476856 А от 05.05.1964). Недостатками данной технологии является использование дорогостоящей кукурузно-глюкознокрахмальной среды для культивирования продуцента,применение высокотоксичного органического растворителя для экстракции антибиотика. Получаемый антибиотик является высокотоксичным(гепатотоксичность,нефротоксичность, способность провоцировать желудочные и маточные кровотечения). К данному антибиотику у многих возбудителей грибковых инфекций родавыработалась лекарственная устойчивость, вследствие чего его применение часто является малоэффективным. Данный антибиотик не обладает антивирусной активностью. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика Амфотерицин Б. Данный антибиотик продуцируется микроорганизмом. Для получения антибиотика продуцент культивируют на органической питательной среде, после чего образовавшийся мицелий экстрагируют растворителем демитилформамидом,дробно осаждают в системе диметилформамид-вода при кислом значении рН среды и промывают 50 водным раствором пропилового спирта. Полученную пасту промывают ацетоном, сушат в вакууме, после чего повторно промывают пропиловым спиртом,отделяют центрифугированием,повторно промывают ацетоном и сушат в вакууме (Способ получения Амфотерицина Б. А.с. СССР 271725 от 30.11.1979). Недостатки данной технологии заключаются в ее сложности, необходимости использования больших количеств токсичных органических растворителей для очистки антибиотика,конечным продуктом данной технологии является антибиотик, обладающий достаточно высокой токсичностью и низкой активностью в отношении многих возбудителей грибковых инфекций. Кроме того, полученный антибиотик не обладает антивирусной активностью. Указанная технология получения антибиотика Амфотерицин В выбрана заявителем в качестве прототипа. Таким образом, известные технологии получения противогрибковых антибиотиков являются недостаточно эффективными, сложными, требуют применения токсических реагентов и приводят к получению антибиотиков, которые характеризуются избирательностью действия только на определенные виды возбудителей микозов, достаточно высокой токсичностью и отсутствием антивирусной активности. Целью изобретения является разработка эффективной технологии получения полиенового антибиотика розеофунгин,обладающего одновременно противогрибковой и антивирусной активностью, которая могла бы использоваться при производстве данного лечебного препарата. Установлено наличие способности продуцировать полиеновый антибиотик розеофунгин у штамма.1128 и его проактиномицетоподобного варианта 1-68. Показано,что проактиномицетоподобный вариант.1-68 обладает более высокой способностью продуцировать антибиотик розеофунгин. Установлено, что введение в состав питательной среды овсяной муки в качестве источника углерода позволяет повысить активность продукции антибиотика,что важно для производственных условий. Показано, что для экстракции антибиотика розеофунгин из мицелиальной массы продуцента может быть использован органический растворитель этиловый спирт, обладающий меньшей токсичностью по сравнению с другими органическими растворителями(метиловый спирт,демитилформамид), что важно в производственных условиях. Применение указанных компонентов технологии позволяет обеспечить наработку антибиотика с высоким выходом целевого продукта,получить целевой продукт с низкой токсичностью и высокой противогрибковой и антивирусной активностью. Сущность изобретения поясняется на следующих примерах Пример 1. Наработка мицелия для выделения антибиотика. Посевной материал (культура.1-68) вносится в количестве 5-8 (к объему среды) в инокулятор со стерильной, охлажденной до 28-30 С овсяной средой(4)2 О 4 2,0 СаСО 3 5,05,0 Овсяная мука 30,0 Агар-агар 20,0 Вода дистиллированная 1 литр рН нейтральный. Выращивание мицелия в инокуляторе ведут 48 часов при температуре 28-30 С при непрерывном перемешивании. Режим аэрации переменный в первые сутки - 0,5 литра воздуха на 1 литр среды в минуту, во вторые сутки - 0,2 литра воздуха на 1 литр среды в минуту. Ферментер промывается холодной, затем горячей водой, просушивается и стерилизуется паром при 2 атм. в течение 1 часа. Для ферментации антибиотика используется жидкий вариант овсяной среды. Как и при приготовлении среды для выращивания посевного мицелия,овсяную муку используют в виде отвара. Посев проводится посевным материалом из инокулятора после охлаждения среды до 28-30 С. Ферментацию ведут в течение 3-4 суток при температуре 28-30 С при непрерывной аэрации и перемешивании. Режим аэрации переменный в первые сутки - 0,5 литра воздуха на 1 литр среды в минуту, во вторые сутки - 0,2 литра воздуха на 1 литр среды в минуту (вопрос о режиме аэрации требует дополнительного исследования,предполагается, что более усиленная аэрация повысит выход антибиотика). Пеногаситель 3(растительное масло) вносится в количестве 1,5-2,5 мл на 1 литр среды. О ходе процесса ферментации розеофунгина судят по накоплению биомассы продуцента, усилению ее желтизны,изменению рН, полноте потребления источников углерода,микроскопическому строению продуцента. Пробы для определения названных показателей берут один раз в сутки. Для нормального (типичного) течения биосинтеза розеофунгина характерно ежесуточное нарастание количества биомассы, которая через трое суток занимает весь объем культуральной жидкости усиление желтой окраски биомассы, обусловленной цветом розеофунгина ежесуточное снижение содержания углеводов в среде слабое подкисление среды - рН на уровне 6,7- 6,9. После окончания ферментации мицелий отделяют от культуральной жидкости путем фильтрации, сепарирования, центрифугирования. Для ускорения процесса фильтрации допускается подогрев культуральной жидкости непосредственно в ферментере при работающей мешалке до 45 С с последующим охлаждением до комнатной температуры. Полученную биомассу необходимо дважды промыть водой и отжать. Для дополнительного обезвоживания мицелий рекомендуется подсушивать между листами фильтровальной бумаги до влажности в пределах 60-70. Выход такого мицелия из 1 л культуры должен составлять в среднем 40-50 г. Пример 2. Выделение антибиотика из биомассы мицелия. Антибиотик экстрагируют из мицелия этанолом двукратно. На 1 г мицелия берут 3 мл, затем 2 мл растворителя. Экстракцию ведут в реакторе,снабженном мешалкой, в течение 2 часов при комнатной температуре. Первый и второй экстракты центрифугируют и объединяют. Этанольный экстракт желтого цвета упаривают в вакууме при температуре 35-40 С до водного остатка. К остатку добавляют 5-кратное количество дистиллированной воды и выдерживают в течение часа при комнатной температуре (можно оставить в холодильнике на ночь). Желтый осадок отфильтровывают или центрифугируют, хорошо отсасывают и тонким слоем высушивают в вакууме. Биологическую активность культуральной жидкости, экстракта из мицелия и порошка розеофунгина определяют по(как рекомендовано НИТИАФ). Подлинность препарата подтверждается наличием корреляции между величиной биологической активности и удельной оптической плотностью - величиной экстинкции(Е 1 1 м при 363 нм). Пример 3. Противогрибковую активность антибиотика розеофунгина определяют путем выявления минимальных подавляющих доз препарата (мкг/мл),блокирующих рост тест-культур. Результаты определения активности антибиотика розеофунгин в отношении широкого спектра возбудителей грибковых инфекций представлены в таблице 1. Показана высокая противогрибковая активность 4 антибиотика розеофунгин по отношению к возбудителям самых различных грибковых заболеваний (дерматомикозов, глубоких микозов,тропических микозов и т.д.). Пример 4. Антивирусную активность антибиотика розеофунгин определяют при обработке вируссодержащего материала антибиотиком в дозах 10 мкг/мл и 50 мкг/мл с последующим определением инфекционной активности обработанного материала. Для анализа антивирусной активности используют штаммы вируса гриппа с различной структурой(вирус Ньюкасла, штамм, вирус Сендай,штамм 960). Определение инфекционности обработанного материала осуществляют путем титрования на куриных эмбрионах. Антивирусную активность оценивают по разности титров вируса(вЭИД 50) в обработанном и контрольном (без антибиотика) материалах. Результаты определения антивирусной активности антибиотика розеофунгин в отношении вируса гриппа приведены в таблице 2. Показана высокая антивирусная активность розеофунгина в отношении вирусов гриппа и парагриппа. Пример 5. Токсичность антибиотика розеофунгин определяют в опытах на животных (белые мыши,морские свинки, кролики). Животным антибиотик вводят перорально,внутрибрюшинно и внутривенно. Оценивают местные и системные токсические реакции, наличие гибели животных. При пероральном способе введения исследуемые дозы препарата составляют от 100,0 мг/кг до 2500,0 мг/кг. При внутрибрюшинном и внутривенном способах введения тестируемые дозы препарата составляют от 2,5 мг/кг до 50,0 мг/кг. Установлено, что максимально переносимая доза препарата при пероральном применении составляет 400,0 мг/кг, при внутрибрюшинном способе применения - 10,0 мг/кг и при внутривенном способе применения -2,5 мг/кг, что указывает на низкую токсичность препарата. Практическая ценность Продуцируемый.1-68 антибиотик розеофунгин обладает выраженной противогрибковой активностью и высокой антивирусной активностью. Преимуществом используемого в технологическом процессе продуцента.1-68 является высокая биосинтетическая активность и способность продуцировать антибиотик, обладающий высокой противогрибковой и антивирусной активностью, а также низкой токсичностью. Преимуществом использования для наработки биомассы продуцента культуральной среды,содержащей в качестве источника углерода овсяную муку, является высокий уровень наработки мицелия,позволяющий получить выход 40-50 г. мицелия с 1 л. Преимуществом использования для экстракции антибиотика из биомассы мицелия органического растворителя этанола является низкая токсичность растворителя и безопасность его применения в производственном процессе. Преимущество данного изобретения заключается в создании эффективной и простой производственной технологии получения лекарственного средства, сочетающего высокую противогрибковую и антивирусную активность,низкую токсичность широкий спектр действия против возбудителей грибковых и вирусных инфекций. Предлагаемый способ получения лечебного средства с противогрибковой и антивирусной активностью позволяет расширить арсенал лечебных противогрибковых и антивирусных препаратов. Таблица 1 Противогрибковая активность антибиотика розеофунгин. Тест-организм Таблица 2 Антивирусная активность антибиотика розеофунгин. Вирусы Вирус гриппа, штамм ///15/30 Инфекционный титр в обратных логарифмах Доза 10 мкг Доза 50 мкг Контроль 4,3 4,2 6,0 6,2 Способ получения антибиотика розеофунгин обладающего противогрибковой и антивирусной активностью, отличающийся тем, что используют продуцент.1-68, культивирование которого осуществляют на питательной среде, содержащей в качестве основного источника углерода овсяную муку в количестве 30 г/л, экстракцию антибиотика из биомассы производят с помощью 96 этилового спирта в соотношении мицелийэтанол 15 в течение 2 часов при комнатной температуре, полученный экстракт упаривают в вакууме при температуре 3540 С, к водному остатку добавляют 5-кратное количество дистиллированной воды,образовавшийся осадок отфильтровывают и высушивают под вакуумом.