Способ выделения мезофильных протопластов пшеницы

(51) 12 5/04 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Способ выделения мезофильных протопластов пшеницы относится к области биотехнологии растений, генной инженерии и сельскому хозяйству. Задачей способа выделения мезофильных протопластов пшеницы с применением низкотемпературной обработки проростков пшеницы для выделения жизнеспособных мезофильных протопластов является повышение качественного и количественного выхода протопластов,удешевление существующей методики за счет исключения антиоксидантов. Проростки пшеницы перед выделением мезофильных протопластов подвергаются низкотемпературной холодовой обработке. При выделении протопластов в результате действия внутриклеточных липооксигеназ повышается активность ферментов пероксидов, что приводит к нарушению целостности мембран клеток. Холодовая обработка проростков перед выделением протопластов снижает активность этих ферментов,что способствует большему выходу жизнеспособных протопластов. Использование дорогостоящих антиоксидантов исключается.(72) Лесова Жаниха Туреевна Жардемали Женис Кадырович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Джардемалиев Ж.К., Карабаев М.К.,Мухаметкалиев М.Т., Бутенко Р.Г. Деление протопластов, выделенных из клеток суспензионной культуры гексаплоидной пшеницы(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕЗОФИЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ ПШЕНИЦЫ 22595 Способ выделения мезофильных протопластов пшеницы относится к области биотехнологии растений, генной инженерии и сельскому хозяйству. Известен способ выделения протопластов растений с применением ферментных растворов. Протопласты представляют собой отправную точку многих методик, используемых для генетической модификации целых растений и клеток, и, в том числе,для соматической гибридизации. Протопласты представляют собой клетки растений без клеточной стенки, которую удаляют при помощи различных мацерирующих ферментов(целлюлаз, пектиназ и др.). Протопласты растений могут сливаться под действием высоких концентраций ПЭГ или при электропорации в определенных условиях заново образуют клеточную стенку являются физиологически активными Джардемалиев Ж.К.,Карабаев М.К.,Мухаметкалиев М.Т., Бутенко Р.Г. Деление протопластов, выделенных из клеток суспензионной культуры гексаплоидной пшеницы// . 198872, .337-342. Слияние протопластов используется для получения разнообразных гибридов и цибридов, как внутри одного вида растений, так и между разными родами,семействами. В стерильных условиях из соматических клеток разных видов выделяют протопласты (живое содержимое клетки без клеточной стенки). Далее либо с помощью микроманипулятора, либо путем химической обработки добиваются слияния соматических клеток разных видов. Из гибридных протопластов получают новые растения. Источником выделения протопластов служит суспензионная культура или мезофилл листьев. Недостатком данного способа является низкий выход жизнеспособных протопластов,использование дорогостоящих антиоксидантов(дитиотрийэтол, аскорбиновая кислота, ингибитор трипсина, глутатион, поливинилпирролидон). Задачей способа выделения мезофильных протопластов пшеницы с применением низкотемпературной обработки проростков пшеницы для выделения жизнеспособных протопластов является повышение качественного и количественного выхода протопластов,удешевление существующей методики за счет исключения антиоксидантов. Поставленная задача решается тем, что проростки пшеницы перед выделением протопластов подвергаются низкотемпературной холодовой обработке. Семидневные проростки пшеницы выдерживаются в холодильнике в течение 2-х суток при температуре 4 С. При выделении протопластов в результате действия внутриклеточных липооксигеназ повышается активность ферментов пероксидаз, что приводит к нарушению целостности мембран. Холодовая же обработка проростков перед выделением протопластов снижает активность этих ферментов,что способствует большему выходу жизнеспособных протопластов (пример 1). Пример 1. Сравнительный выход мезофильных протопластов пшеницы Ферментативный раствор/выход жизнеспособных протопластов, клеток/мл Растворы используемой методики Раствор с антиоксидантами Обработка проростков при температуре 3,9-4,1 С. 3 5 6,4-7,910 4,9-5,810 8,1-9,0105 При использовании растворов используемой методики (пример 1) выход мезофильных протопластов составляет 6,4-7,9103 протопл./мл,при использовании раствора с антиоксидантами 4,9-5,8105 протопл./мл. Предлагаемый способ низкотемпературной обработки проростков пшеницы в течение 2-х суток при температуре 3,9-4, обеспечивает выход жизнеспособных мезофильных протопластов в 1,8-2 раза больше- 1,0-1,4106 протопл./мл за счет снижения активности ферментов пероксидаз и повышения целостности мембран. Применение дорогостоящих антиоксидантов исключается. Таким образом, предложенный нами способ выделения мезофильных протопластов с применением низкотемпературной обработки проростков пшеницы обеспечивает высокий выход жизнеспособных протопластов пшеницы и исключает применение дорогостоящих антиоксидантов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения мезофильных протопластов пшеницы, включающий использование ферментного раствора, отличающийся тем, что выделяют протопласты из проростков пшеницы, которые предварительно подвергают холодовой обработке при низкой температуре 3,9-4,1 С.