Способ многоэтапного скрининга трансгенных семян пшеницы

(51) А 01 Н 1/04 (2006.01) А 01 Н 4/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ полученных методом агробактериального пипетирования. Способ много-этапного скрининга предположительно трансгенных семян пшеницы с генами ФЭПК и 1 на устойчивость к антибиотикам включает стерилизацию семян высадку семян на селективные среды, содержащие различные концентрации антибиотиков получение стерильных проростков адаптацию их к условиям. Скрининг проводят по этапно на питательных средах,содержащих высокие концентрации канамицина или гигромицина (50 мг/л) -5 дней с последующим понижением концентрации антибиотиков (25 мг/л) - 4 дня. Предложенный способ является генотип независимым, применим к большому количеству генотипов пшеницы казахстанской и американской селекции, включает по этапное снижение концентрации антибиотиков в питательной среде,что значительно повышает точность опыта,эффективность отбора и увеличение выхода жизнеспособных трансгенных растений.(72) Кершанская Ольга Ивановна Джангалина Эрика Димашевна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ МНОГОЭТАПНОГО СКРИНИНГА ТРАНСГЕННЫХ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для селекции трансформантов пшеницы в условиях, 21165 Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для селекции трансформантов пшеницы в условиях, полученных путем- трансформации методом пипетированияс целевым геном на рыльце пестика цветков. Способ многоэтапного скрининга предположительно трансгенных семян пшеницы с целевыми генами ФЭПК и 1 на устойчивость к антибиотикам гигромицину и канамицину,входящими в конструкции соответствующих генов,включает стерилизацию семян, высадку семян на селективные среды,содержащие различные концентрации антибиотиков, получение стерильных проростков, адаптацию и высадку их в открытый грунт. Известен способ скрининга предположительно трансгенных семян пшеницы полученных методом пипетированияна рыльце цветков (., К..(. / ,72 (1990) 233-244) на устойчивость к канамицину. Однако этот способ предполагает проведение скрининга на высоких концентрациях канамицина и разработан только для яровой пшеницы сорта. Известен способ отбора трансформантов томата(Седов Г.И., Чесноков Ю.В. Способ отбора трансформантов томата. Патент РФ 2037289, кл. А 01 Н 1/04, А 01 Н 1/04, 1992 г.) на селективной питательной среде в присутствии канамицина. Однако этот способ является классическим для двудольных растений и состоит только из одного этапа. Задача изобретения разработка способа многоэтапного скрининга трансгенных семян пшеницы. Технический результат повысить эффективность отбора и ускорить процесс получения трансформантов. Поставленная задача решается следующим образом семена стерилизуются (первый этап) и высаживаются на питательные среды, содержащие селективные агенты (канамицин или гигромицин). Выращивание семян предположительно трансгенных растений проводят поэтапно на селективных средах, содержащих на начальном этапе (второй этап) высокие концентрации антибиотиков с последующим их понижением(третий этап). Жизнеспособные проростки,полученные из предположительно трансгенных семян высаживают в открытый грунт (четвертый этап). Способ осуществляют следующим образом 1 этап - стерилизация семян предположительно трансгенных растений. Для сортов американской и казахстанской селекции применялись различные протоколы стерилизации. Семена сортов американской селекции стерилизовали 70 спиртом и белизной. Для семян казахстанских сортов требуется более жесткая стерилизация, включающая 2 дополнительную обработку детергентами и фунгицидами в высокой концентрации. В качестве детергентов использовали мыльный раствор, а в качестве фунгицида применяли 10 оксихлорид меди. После процедуры стерилизации семена пятикратно промывали стерильной дистиллированной водой. 2 этап - высадка стерильных семян на питательную среду Мурасиге-Скуга в условиях,содержащую высокие концентрации антибиотиков. Концентрация канамицина составляет 100 мг/л или 50 мг/л, а гигромицина - 50 мг/л. Через 5 дней проводят отбор и подсчитывают количество жизнеспособных проростков. 3 этап - высадка проростков, прошедших скрининг на высоких концентрациях антибиотиков,на питательную среду Мурасиге-Скуга в условияхс пониженными концентрациями канамицина и гигромицина. Концентрация канамицина составляет 50 мг/л или 25 мг/л для разных групп генотипов. Концентрация гигромицина - 25 мг/л. Через 4 дня проводят отбор и подсчитывают количество жизнеспособных проростков. 4 этап - жизнеспособные проростки, после третьего этапа скрининга высаживают в открытый грунт. Проростки высаживают в кюветы с почвой,поливают и прикрывают прозрачной пленкой для адаптации к условиям. Через 2-3 дня пленку снимают и через 7-10 дней высаживают жизнеспособные растения в открытый грунт. Пример 1. Стерилизация семян сортов американской селекции. Все операции проводятся в асептических условиях в ламинарном боксе. Семена помещают в 70 спирт на 5 минут, затем переносят в 20 на 30 мин., который получают путем разбавления в соотношении 13 любого коммерческого отбеливателя типа Белизна, АС,Доместос. Далее семена пятикратно промывают стерильной дистиллированной водой и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую антибиотики. Семена выращивают при температуре 24-25 С на свету. Пример 2. Стерилизация семян сортов казахстанской селекции. Семена замачивают в концентрированном мыльном растворе на 30 мин и затем их промывают в проточной воде в течение 30 минут. Эти процедуры проводят вне ламинарного бокса. Все дальнейшие операции проводятся в асептических условиях в ламинарном боксе. Промытые семена помещают в 1) 70 спирт - 5 минут, 2) 20- 5 мин., который получают путем разбавления в соотношении 13 любого коммерческого отбеливателя типа Белизна, АС,Доместос, 3) 10 оксихлорид меди с каплей 40-20 мин. Далее семена пятикратно промывают стерильной дистиллированной водой и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую антибиотики. Семена выращивают при температуре 24-25 С на свету. Пример 3. Проведение скрининга на устойчивость к антибиотикам. Исследования проводили на предположительно трансгенных семенах,полученных путем - трансформации 21165 методом пипетированияс целевым геном. В работе использовали сорта американской и казахстанской селекции. Семена стерилизуют и высаживают на питательную среду с различными концентрациями канамицина по-этапно. В табл. 1 представлена зависимость количества выживших растений и частоты трансформации от концентрации канамицина на различных этапах скрининга. Из данных, представленных в табл. 1 видно, что выращивание семян на питательной среде, содержащей 100 мг/л канамицина на начальном этапе скрининга с последующим понижением концентрации до 50 мг/л приводит к гибели всех семян, т.е. концентрация канамицина 100 мг/л является летальной для семян пшеницы. Применение такой процедуры скрининга не эффективно и не рационально для отбора предположительно трансгенных семян пшеницы. Таблица 1 Скрининг на устойчивость к канамицину предположительно трансгенных форм пшеницы, полученных методом агробактериального пипетирования. При концентрации канамицина на начальном этапе скрининга 50 мг/л с дальнейшим его понижением до 25 мг/л приводило к выживанию в среднем 5 проростков. Данная схема проведения скрининга является более эффективной и способствует быстрому отбору трансформантов. Пример 4. Проводят аналогично примеру 3, с той лишь разницей, что в качестве селективного агента используют гигромицин. При проведении скрининга на устойчивость к гигромицину (табл. 2) использована та же схема, т.е. первоначальное выращивание семян на высоких концентрациях антибиотика (50 мг/л) с последующим понижением(25 мг/л). Частота трансформации для предположительно трансгенных растений пшеницы с геном ФЭПК составила 8,2. Таким образом,проведение по-этапного скрининга предположительно трансгенных семян пшеницы на устойчивость к антибиотикам, входящим в конструкции соответствующих генов, является наиболее оптимальным для ускоренного выявления и отбора жизнеспособных трансформантов. Таблица 2 Скрининг на устойчивость к гигромицину предположительно трансгенных форм пшеницы, полученных методом агробактериального пипетирования. Предлагаемый способ скрининга трансгенных семян пшеницы позволяет обеспечить по сравнению с известными способами следующие преимущества- Генотип - независимый способ скрининга предположительно трансгенных семян пшеницы применим к большому количеству разнообразных 21165 генотипов пшеницы казахстанской и американской селекции.- Способ основан на предварительном учете генотипического порога чувствительности к антибиотикам, что значительно повышает точность опыта.- Способ включает поэтапное снижение концентрации антибиотиков в питательной среде,что обеспечивает возможность повышения эффективности отбора и увеличение выхода жизнеспособных трансгенных растений. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ многоэтапного скрининга трансгенных семян пшеницы, включающий стерилизацию семян,высадку семян на селективные среды, получение стерильных проростков, адаптацию их к условиям,отличающийся тем,что скрининг трансгенных семян пшеницы проводят поэтапно на питательных средах, содержащих на начальном этапе высокие концентрации канамицина или гигромицииа (50 мг/л) в течение 5 дней с последующим понижением концентрации антибиотиков (25 мг/л) в течение 4 дней и высадку проростков в открытый грунт.