Штамм Cyanobacterium sp. IPPAS B-1200 в качестве сырья для производства биотоплива

(51) 12 1/12 (2006.01) 12 7/64 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма.-1200, который может быть использован в качестве продуцента жирных кислот для производства биотоплива. Достигаемый технический результат расширение арсенала штаммов микроорганизмов,используемых для производства биотоплива. Штамм.-1200 содержит в клетках в больших количествах С 14 миристиновую и миристолеиновую кислоты - 30 и 10 соответственно, и 16 пальмитиновую и пальмитолеиновую кислоты - 17 и 40 от общего количества жирных кислот, а также продуктивно растет при широком диапазоне температур. Эти уникальные характеристики делают штамм потенциальным продуцентом биотоплива.(72) Сарсекеева Фариза Кудайбергеновна Заядан Болатхан Казыханович Лось Дмитрий Анатольевич Садвакасова Асемгуль Калыйкумаровна Усербаева Айжан Асхаровна Болатхан Кенжегуль(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологии и биотехнологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан-1200 В КАЧЕСТВЕ СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОТОПЛИВА Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма.-1200, который может быть использован в качестве продуцента жирных кислот для производства биотоплива. Современная цивилизация нуждается в топливе во вс нарастающем объеме, и сегодня мировые поставки жидкого топлива почти полностью зависят от нефти. По прогнозам специалистов, в ближайшие десятилетия ожидается дальнейшее снижение производства традиционных источников энергии, в том числе и добычи нефти. В связи с этим растет интерес к альтернативным возобновляемым источникам энергии, способным обеспечить стабильное производство энергии в течение неопределенно долгого периода времени. В поиске возобновляемых и альтернативных ископаемым видов топлива, растет интерес к использованию определенных видов цианобактерий в качестве сырья для биотоплива. Технология использования цианобактерии в качестве топливного сырья занимают одно из центральных мест среди подходов современной альтернативной энергетики. Контроль длины углеродной цепи жирных кислот (ЖК) обеспечивает механизм производства биотоплива с заданными свойствами, так цепи длиной С 10-14 ЖК отлично подходят для производства реакторного биотоплива, тогда как С 16-18 ЖК можно использовать для производства биодизеля. Большинство штаммов микроводорослей имеют высокое содержание ненасыщенных жирных кислот,что не позволяет получать без дополнительной обработки на основе их липидов топливо с низкими цетановыми числами и хорошей устойчивостью к окислению. Слишком высокие цетановые числа увеличивают вязкость топлива при низких температурах. Поэтому смесь жирных кислот С 140, С 160, С 180 и С 181, входящих в состав липидов масла цианобактерий и некоторых штаммов микроводорослей, является наиболее подходящей для продукции биотоплива ( .//. . - 2009. .2. - . 759-766). Известен штамм микроводоросли, который используют для получения полиненасыщенных жирных кислот способом понижения концентрации хлоридов в культуральной жидкости (Патент 7163811 США,МПК С 12 Р 7/64 23 9/00, опуб. 16.01.2007 г.). Недостатком данного штамма является высокое содержание ненасыщенных жирных кислот (до 53,9 от массы масла) в биомассе микроводорослей, что значительно усложняет получение качественного биотоплива из-за возможности их окисления по непредельным связям. Известны штаммы 11204 и 11220, продуцирующие в разных количествах углеводороды н-гептадецен, нгептадекан, н-нонадецен и н-нонадекан, требующие для культивирования витамины (В 1 В 12 и биотин) и смену среды с богатой азотистыми соединениями на 2,,.// . - 2013. -9.-. 178-187). Недостатком данных штаммов является то, что при культивировании используются витамины (1,В 12 и биотин), что значительно увеличивает стоимость производства биомассы и липидов данной микроводоросли. Кроме того, используется способ культивирования, включающий смену среды с богатой азотистыми соединениями на обедненную,что усложняет технологию производства. Известен штамм-31-31 //. - 2012. - . 105. . 120-127), который позволяет получать липиды,включающие 60-68 насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе, в том числе, пальмитиновой (С 160), стеариновой (С 180) и олеиновой кислоты (С 181). Недостатком данного штамма является что при культивировании не получают липиды с высоким содержанием насыщенных кислот содержание пальмитиновой кислоты составляет 16.44-26.46, с стеариновой 7.07-14.92 от общего количества жирных кислот в липидах, в зависимости от используемой для культивирования среды. Наиболее близким к предлагаемому штамму.-1200 является штаммА 1123 (Патент 2508398 РФ,МПК 712 1/89 С 12 Р 7/64 12 1/12, опубл. 27.02.2014 г.),который обладает высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе липидов, в том числе,пальмитиновой, в качестве сырья для производства моторных топлив. Штамм микроводорослиА 1123 выделен из горячего источника у подножия вулкана Мутновский (Камчатка), идентифицирован в ИЦиГ СО РАН и депонирован в Коллекции микроводорослей ИФР РАН под регистрационным номеромС-616. Штамм А 1123 имеет следующую морфофизиологическую характеристику. Клетки круглые, шаровидные, с тонкой оболочкой без слизи, размером 3-5 мкм с одиночным пиреноидом размером 1 мкм,размножение происходит 4-8 автоспорами. На агаризованной среде ВВМ образует колонии зеленого цвета с ровным краем. Штамм авто- и миксотрофный. Температура культивирования от 20 до 35 С. Штамм растет на минеральной среде ВВМ,не требует для роста подачи в среду углекислого газа. Достаточный период освещения для роста - до 16-18 ч в сутки. При окрашивании флуоресцентным красителемв цитоплазме клеток визуализируются капли липидов. Штамм не склонен к осаждению как в культуре, так и на стенках культивационной установки,сохраняет аксеничность при хранении. Штамм развивается вне зависимости от сезона года. Полученный штамм обладает повышенным содержанием липидов с насыщенными и мононенасыщенными жирными кислотами. Общее содержание данных жирных кислот, определенных методом газовой хроматомасс-спектрометрии,составило 75, в том числе пальмитиновой - 38,что позволяет получать сырье для производства биотоплива с повышенным содержанием насыщенных жирных кислот с улучшенными свойствами после обработки биомассы ультразвуком и экстракции растворителями. Содержание липидов штаммаА 1123 при миксотрофном культивировании составило 32 от сухого веса. Недостатками данного штамма является применение ультразвука и экстракции растворителей для улучшения свойств насыщенных жирных кислот и использование органических веществ при миксотрофном культивировании. Задачей зявляемой полезной модели является получение штамма цианобактерии, обладающего способностью продуцировать липиды с высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот, пригодных для применения их в качестве сырья для продукции биотоплива высокого качества. Технический результат - расширение арсенала штаммов микроорганизмов, используемых для производства биотоплива. Технический результат достигается предлагаемым штаммом.-1200 в качестве сырья для производства биотоплива. Предлагаемый штамм.-1200 обладает высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе липидов, в том числе, пальмитиновой, в качестве сырья для производства моторных топлив и миристиновой для производства реакторного топлива. Согласно исследованиям авторов полезной модели, штамм.-1200 первый описанный цианобактериальный штамм,который содержит большое количество С 14 жирных кислот миристиновой (30) и миристолеиновой(10). Предлагаемый штамм выделен из соленного озера Балхаш (соленность воды 4 г/л) Республики Казахстан. Отобран по скорости роста, накоплению биомассы и липидов и составу жирных кислот. Штамм.-1200 депонирован в Коллекции микроводорослей Института физиологии растений Российской Академии наук под регистрационным номером-1200 от 14 февраля 2014 года. Морфология и ультраструктура клетки неподвижные, единичные или в парах после деления, без оболочки, овальной формы с закругленными концами,длина 4,5-7,5 микрометров, ширина 2,0-4,5 микрометров, прямые или немного дугообразные (фиг.1). Радиальные тилокойды расположены по сечению, тогда как продольные тилокойды вдоль клетки. Снаружи тилакойдов находятся фикобилисомы - специфические образования диаметром 18 нм, в центре клетки располагается нуклеоид (фиг.2). Культуральные признаки на поверхности агаризованной среды Заррука колонии синезеленые, блестящие, круглые, однородные, с прямыми краями. Условия культивирования на среде Заррука при температуре инкубации 30 С, среда-7. Состав среды Заррука г/л Гидрокарбонат натрия (НСО 3) - 16,8 Сульфат калия (24) - 1,0 Нитрат натрия (О 3) - 2,5 Сульфат магния семиводный (О 4 х 7 Н 2 О) - 0,2 Хлорид натрия- 1,0 Хлорид кальция (СаС 2) - 0,04 Калий фосфорнокислый двузамещенный (К 2 НРО 4) 1,0 р-р ЭДТА - 1 мл. Режим стерилизации - 30 минут при 112 С. Хранение штамма осуществляется на агаризованной минеральной среде Заррука, при 1214 С и слабом освещении (300-500 люкс). Максимальный срок хранения - 2-3 месяца. Также был проведен анализ нуклеотидной последовательности генов 16 рРНК. Для полученных последовательностей были определены ближайшие гомологи среди доступных нуклеотидных последовательностей,депонированных в базе данных, среди которых отбирали имеющие максимальную степень идентичности. Поиск проводили, используя алгоритм . Последовательность штамма.-1200 имела высокий процент гомологии(99) с последовательностью штаммаРСС 7202 и другими некультивируемыми бактериями. Последние это представители цианобактериальных разновидностей, которые были подвергнуты метагеномному анализу (фиг.3). Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Определение скорости роста штамма.-1200 при различных температурах Способность расти в широком диапазоне температур является хорошим признаком для введения штамма в биотехнологический процесс,поскольку допускает отклонение суточной температуры культивирования в значительных пределах. Культивирование штамма проводят в лабораторных условиях на среде Заррука со стандартным составом,7 и при различных значениях температур. Период удвоения штамма - 9-11 часов в экпоненциальной фазе при температурах культивирования от 24 С до 32 С. Высокую 3 скорость роста штамм показал при температуре 32 С. При пониженной температуре (24 С-27 С) культура имеет долгую лаг - фазу, после котрой скорость роста была как при температуре 32 С. При высокой температуре (39 С) инкубирования рост клеток замедлился уже с первых суток культивирования (фиг.4). Пример 2. Анализ состава жирных кислот липидов штамма.-1200 Для определения количества общих липидов на сухой вес клетки и жирнокислотного состава,штаммы цианобактерий культивировали на среде Заррука при температуре 32 С и 22 С и непрерывном освещении 110 /2/. При достижении стационарной фазы роста культуры разделяли для получения сухого веса и определения жирных кислот. Для количественного определения общих липидов клетки, очищенные от среды,обрабатывали метиловым спиртом и получали сухую навеску, для определения состава жк клетки фиксировали горячим (60 С) изопрапонолом и 0,02 ионолом и инкубировали в водяной бане при 65 С 10 минут. После чего с добавлением к суспензии метанола и ацетилхлорида (91) и выдержки 60 минут при 70 С получали метиловые эфиры жирных кислот, которые разделяли на ГЖХМС 7890 с 60 м капилярной колонкой.. - 1989. - . 37-38). Хроматоргамма жирных кислот клетки штамма.-1200 показана на фиг.5. Клетки штамма накопливают до 60 мг липидов на один грамм сухого веса. Липиды характеризуются довольно простым жирнокислотным составом и содержат равное количество как насыщеных так и ненасыщенных жирных кислот. При этом доминируют миристиновая (140), миристолеиновая (1419),пальмитиновая (160) и пальмитолеиновая (1619) ЖК. Уникальной особенностью штамма является высокое содержание в клетке миристиновой и миристолеиновой жирных кислот, в количестве 30 и 10 от общего числа жк соответственно Таблица 1 Жирнокислотный состав штамма. -1200 Жирные кислоты 140 миристиновая 1419 миристолеиновая 160 пальмитиновая 1619 пальмитолеиновая 180 стеариновая 181 олеиновая а. Отклонение в пределах 0.1-1. Сумма 1819 и 18111 ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Штамм.В-1200,депонирован в РГП на ПХВ Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК под номером 0676, используемый в качестве сырья для производства биотоплива