Способ получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых “Биопрожест” в виде сухого порошка

(51) 01 63/00 (2011.01) 12 1/20 (2011.01) 61 35/66 (2011.01) 61 9/14 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Для глубинного выращивания используют посевные и ферментационные среды. В качестве посевной среды используют дрожжеполисахаридную среду. Ферментационная среда на основе соевой муки и крахмала. В инокулятор засевают посевной материал, полученный смывом со скошенного агара рабочей партии штамма.шт. В 12 С. К 1826 часам роста заканчивается споро- и кристаллообразование культуры. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. Культивирование заканчивают к 21-30 часам роста после высыпания спор и кристаллов. Концентрирование полученной культуральной жидкости проводят сепарированием или центрифугированием. Концентрат высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем каолином и получают сухой порошок. Применение препарата в лабораторно - полевом опыте вызывает 90-98 гибель личинок колорадского жука 1-2 возрастов.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Тен Олег Андреевич Черемисова Татьяна Геннадьевна Бейсембаева Марал Жусупкызы(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ БИОПРОЖЕСТ В ВИДЕ СУХОГО ПОРОШКА Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству бактериальных инсектицидов,предназначенных для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в том числе с колорадским жуком. В настоящее время борьба с вредителями сельскохозяйственных культур в Казахстане базируется исключительно на использовании химических средств защиты растений, что приводит к нарушению экологического равновесия в природной среде и появлению резистентных форм фитофагов. В этой связи актуальной проблемой является разработка биологических мер борьбы с вредными насекомыми, в частности, создание и использование препаратов на основе микроорганизмов - естественных антагонистов насекомых. Наибольшее распространение во всем мире получили энтомопатогенные препараты перорального действия,среди которых первостепенное значение приобрели бактериальное биопрепараты на основеразных подвидов и вирусные - на основе бакуловирусов. С каждым годом интерес квозрастает, что обусловлено многими ценными свойствами этой бактерии легко размножается,синхронно спорулирует на многих питательных средах по завершении вегетативного роста образует не только спору, но и параспоральное тело кристаллический эндотоксин,являющийся важнейшим биологически активным веществом,поражающим насекомых. Некоторые разновидности этой бактерии помимо кристаллического эндотоксина выделяют в среду культивирования термостабильный-экзотоксин и ферменты, токсичные для насекомых. Споры бактерии не требуют каких-то особых условий для своего длительного хранения. Энтомопатогенные бактерии на основехорошо растут на искусственных питательных средах,поэтому их легко нарабатывают в заводских условиях с использованием больших ферментеров. Микроб технологичен, то есть выдерживает различные технологические манипуляции сепарацию, вакуум-выпаривание, различные способы сушки, смешивание с наполнителями и другие операции. В высушенном состоянии готовый продукт хорошо сохраняется в течение года, не теряя своих первоначальных свойств. Все эти качествавыдвинули ее на первое место в арсенале биологических средств защиты растений от вредных насекомых. В мире уже создано несколько десятков промышленных форм препаратов, в основе которых содержится та или иная разновидность на основе споро- и кристаллообразующих штаммов. Только в Китае их количество достигает 70 наименований, в России - 20. Биопрожест в виде сухого порошка инсектицидный препарат, полученный в процессе биосинтеза из.шт. В 12 С глубинным культивированием с последующим концентрированием, сушкой и стандартизацией готового препарата каолином. 2 Известен способ получения препарата против жесткокрылых насекомых патент 2108384, кл. 1 А 01 63/00, опубл. 10.04.98 патентообладатель Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов - Штаммпродуцент эндотоксина против жесткокрылых насекомых и способ его культивирования. Способ культивирования штамма заключается в следующем для получения эндотоксина готовят дрожже-полисахаридную питательную среду (ДПС кормовые дрожжи - 30 г/л, кукурузная мука 15 г/л),засевают ее штаммом ВКПМ В - 6649, культивируют в ферментере до начала споруляции (26-30 часов),затем полученную культуральную жидкость отбирают в количестве 90-95 от объема,дображивают при комнатной температуре (24 часа),затем центрифугируют, получая при этом фугат и пасту, из которой готовят конечный продукт. Концентрация жизнеспособных спор в КЖ,получаемой в результате ферментации, составляет до 2,1 млрд. спор/мл. Итого вес цикл культивирования длится 50-56 часов. Недостатками данного способа являютсяпродолжительное время культивированияиспользование в качестве компонентов питательной среды дефицитных кормовых дрожжей(БВК) и кукурузной муки. На основе штаммаН 8 ВКПМ В-6306 создан препарат Новодор, синтезирующий белковый эндотоксин,токсический для жесткокрылых насекомых ( 91/14369). На его основе в России создан инсектицидный препарат Колорадо (Инсектицидный препарат Колорадо против жесткокрылых насекомых и штамм бактерий, используемый для получения инсектицидного препарата,патент 2081583, кл. 1 А 01 63/00, опубл. 20.06.97 патентообладатель Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов). Способ получения препарата является наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту и заключается в следующем Готовят питательную среду путем смешивания компонентов. В качестве компонентов используют кормовые дрожжи, кальций хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, гидрат окиси калия. После стерилизации среды ее засевают в асептических условиях. Продолжительность ферментации 48-56 часов. Процесс оканчивают, когда 50-60 клеток завершило стадию спорообразования. Концентрация жизнеспособных спор в КЖ,получаемой в результате ферментации, составляет не менее 1,6 млрд. спор/мл. Концентрирование производят любым из известных способов сепарирование, центрифугирование, мембранная фильтрация, распылительная сушка. Содержание токсического белка в концентрате составляет от 40 мг/г до 100 мг/г. Препарат в форме порошка содержит 40-60 концентрата спорокристаллического комплекса с остатками питательной среды и 60-40 наполнителя (каолина и натрия хлористого). Биологическую активность определяли на личинках колорадского жука-возраста на картофеле. Недостатками этого способа являютсяпродолжительное время ферментациииспользование в качестве одного из компонентов питательной среды дефицитных кормовых дрожжей (БВК). Целью изобретения является уменьшение времени культивирования инсектицидного штамма с заменой ферментационной среды на новую питательную среду из отечественного сырья с сохранением биологической активности препарата Биопрожест в виде сухого порошка на пилотной установке филиала НЦБ РК МОН РК в г. Степногорск. Способ осуществляется следующим образом. Для глубинного выращивания используют посевные и ферментационные среды. В качестве посевной среды используют дрожжеполисахаридную среду (ДПС кормовые дрожжи - 30 г/л, кукурузная мука- 15 г/л). В инокулятор засевают посевной материал, полученный смывом со скошенного агара рабочей партии штамма.шт. В 12 С. Через 14-16 часов начинается споро - и кристаллообразование культуры, заканчивающееся к 18-26 часам роста. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды используют среду следующего состава, г/л соевая мука- 10,0 калия фосфат двузамещенный -1,5 аммоний сернокислый- 3,0 вода водопроводная до 1 л.- 7,3 - 7,4. температура давление в аппарате количество оборотов мешалки расход воздуха Культивирование заканчивается к 21-30 часам роста после высыпания спор. Концентрирование полученной культуральной жидкости сепарированием или центрифугированием. Концентрат высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем - каолином и получают смачивающий порошок. Состав смачивающего порошкаконцентрат спорокристаллического комплекса с остатками питательной среды -40-50, натрия хлорид или сульфат аммония - 5 каолин до 100 . Существенным отличительным признаком предлагаемого способа от прототипа является использование соевой муки и крахмала в приготовление питательной среды, что позволяет заменить дефицитные кормовые дрожжи и использование штамма.шт. В 12 С, что позволяет сократить время культивирования до 45-54 часов. Пример 1. Стерильную среду РПА разливают в стерильные пробирки, диаметром 16 мм, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией, полученной в результате смыва культуры с косяка высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301) в течение 72 часов. Для посева в инокулятор фирмыобъемом 7 л с рабочим объемом 4 л используют суспензию, полученную путем смыва культуры с косяка рабочей партии в соотношении не менее 1 млн. спор на мл. В подготовленный стерильный инокулятор объемом, соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду ДПС в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивирования К 26 часу роста заканчивается спорообразование. Титр жизнеспособных клеток определяют методом Пастера - Коха - 12,3 млрд.спор/мл, концентрация белка токсина -2,2 мг/мл. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды применяют среду следующего состава, г/л соевая мука- 10,0 калия фосфат двузамещенный - 1,5 аммоний сернокислый- 3,0 вода водопроводная до 1 л.- 7,3 - 7,4. Биосинтез инсектицидного штамма в ферментере проходит 30 часов при том же режиме культивирования до полного высыпания спор и кристаллов. Титр жизнеспособных клеток - 29 млрд.спор/мл, концентрация белка токсина - 1,36 мг/мл. Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой в 3 пасту добавляют 5 натрия хлористого. Сушат при температуре на входе (135-140) и на выходе (7075). Сухой порошок стандартизируют каолином до титра жизнеспособных клеток (15 5) млрд. спор/г. Применение препарата в лабораторно-полевых условиях вызвало 90 гибель личинок 1 -2 возраста. Опыты по проверке биологической активности проводились в ТОО Институт защиты и карантина растений г. Алматы. Пример 2. Стерильную среду РПА разливают в стерильные пробирки, вместимостью 15 мл, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией,полученной в результате смыва культуры с косяка температура давление в аппарате количество оборотов мешалки расход воздуха высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301) в течении 72 часов. Для посева в инокулятор фирмыобъемом 7 л с рабочим объемом 4 л используют суспензию,полученную путем смыва культуры с косяка рабочей партии в соотношении не менее 1106 спор на мл. В подготовленный стерильный инокулятор объемом,соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду ДПС в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивирования К 23 часу роста заканчивается спорообразование. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды используют среду следующего состава, г/л соевая мука- 10,0 калия фосфат двузамещенный - 1,5 аммоний сернокислый- 3,0 вода водопроводная до 1 л.- 7,3 - 7,4. Биосинтез инсектицидного штамма в ферментере проходил 29 часов при том же режиме культивирования до полного высыпания спор и кристаллов. Титр жизнеспособных клеток - 1,72109 спор/мл,концентрация белка токсина-1,75 мг/мл. Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой в пасту добавляют 5 натрия хлористого. Сушат при температуре на входе (135 - 140) и на выходе (7075)С. Сухой порошок стандартизируют каолином до титра жизнеспособных клеток (1,50,5) 1010 спор/г. Применение препарата в лабораторном опыте вызвало 98 гибель личинок колорадского жука 1-2 возраста, в мелкоделяночном - 93,4, полевом опыте гибель личинок составляла - 90. Опыты по проверке биологической активности проводились в ТОО Институт защиты и карантина растений г.Алматы. Использование предлагаемого способа получения позволяет по сравнению с прототипом при использовании новой среды сократить срок изготовления препарата с сохранением качества и биологической активности препарата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых Биопрожест путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов видав условиях аэрации на питательной среде,концентрирование полученной культуральной жидкости центрифугированием и распылительной сушкой, отличающийся тем, что в состав питательной среды входят компоненты следующего состава, г/л соевая мука- 10,0 калия фосфат двузамещенный - 1,5 аммоний сернокислый- 3,0 вода водопроводная до 1 л. 7,3 - 7,4 а для синтеза активного начала используют культуру.шт. В 12 С.