Способ получения 4`-дезокси-13(S)-дигидро-4`-йододоксорубицина

двух возможных при С-1 З стереоизомерии гГ-дезокси-тз-дигидро-еГ-иододоксорубициное. Новое соединение формулы-Од), называемое далее как РСЕ 24883. является по ЛВЗННМ В КЗЧВСТВВ ПРОТИВООПУКОЛВОГОсредствам проявляет активность на экспериментальных опухолях. сравнимую с ак- тивностью сГ-дезоксо-Ф-йододоксоруби цина формул ы Н). Субстратомйдля микробноГО СТВПВОСЕПВ КТИВ НО ГО ЕОССТЭ НОВЛВНИЯ Я Вляется полусинтетический аналог доксорубицина. у Получают целевой продукт формулы (Н) 0 ОН 0Морфология мутантного штамгла М 87 Р. 1. не отличается от таковой материнского штамма 5. реисенив АТСС 31428. в то время как обе культуры четко различаются по своНМ КУЛЬТУОЗЛЬЪЗЫМ И бИОХИМИЧЕСКИМ ХЗПЗК теристикам. Так. мутантный штамм М 87 Р. 1. не продуцирует на агаровой среде от сопоМВННОФКЕПТОГО ДО ЛИМОННСЪЖЕЛТОГО РЗСТВО ОИМОГО ПИГМЗНТЯ, КОТОПЫЙ ЯВПЯЗТСЯ характерным для материнского штамма 5. реисеоиз АТСС 31428.Кроме того. мутантный штамм М 87 Р.1. может избирательно превращать соединение (1) в соединение (Н). тогда как материнский штамм 3. реисегшз АТСС 31428 не избирателен в этом отношении. Это свойство мутанта М 8 Р.1. делает его высоко полезным, как описано в заявке. .Стереоизбирательное биоп реобразование может быть осуществлено о размножающеися культуре 8. реисепив штамм М 87 17.1. при добавлении соединения (Е) в качестБВ СУСТОЭТЗ В КУЛЪТУВЗЛЬНУЮ СПЕЦ) В ИНКУ бационном периоде.Соединение Е может быть набата-гене в форме гидрохлорида после солгобчпьтзациът в стерильной дистиллированной воде. Культуру выращивают в питательной среде, содержащей ИСТОЧНИК УГЛЕВОДЗ. Э-ЕЭГЦЛЧМЕП УСВЗИВЗВМЫЙ УТЛЕВОД. И ИСТОЧНИК 3.5018. Т.В. УСВЭИВЗЕМОЭ СОЕДИНЕНИЕ ЭЗОТЗ ИЛИ ВЛКО вый материал. Предпочтительные ьтсточникн углерода включают глюкозу. сахарозу. глицероп. крахмал. кукурузный крахмал. декстрин. мелассу и тому подобные. Предпоч 1594ТИТВЛЪННВ ИСТОЧНИКИ ЭЗОТЗ ВКЛЮЧЗЮТ настои от замачивания зерна. дрожжевой акстракт. пивные дрожжи. соевую муку. муку из семи хлопка. кукурузную муку. казеин. рыбную муку. сухие остатки дистилляции,животный понтон. мясной экстракт. соли аммония и др. может быть выгодно использовано сочетание таких источников углерода иазота.Процесс биопревращения может длиться примерно от 72 часов до 8 дней. Инкубаци-онная температура в процессе биопревращения может быть в интервале примерно от 25 С- до 37 С. предпочтительно 29 С. Содержимое бродильных сосудов аэрируют взбалтыванием при 250 оборотах В МИНУТУ ИЛИ ПВПВМВШИБЗНИВМ СТВДИЛИЗО ванным воздухом. чтобы способствовать росту микроорганизма и таким образом повысить эффективность процесса превращения.Ход реакции микробного превращения контролируют взятием образцов бродильной среды при различных временных интервалах и экстракцией при рН 8.0 смесью дихлорметан-метанол в отношении 91. Когда пробу органического экстракта подвергают тонкослойной хроматографии, используя В КЗЧЕСТВВ ЭЛЮЕНТЗ СМВСЬ хлороформа. МВтанола. уксуснойкислоты и воды в отношении 802073 по объему. соединение РСЕ24883 (Н) появляется при значении НЕ среды.0.50. тогда как 4-дезокси-д-йододоксорубицин (1) находят при Н 0.60. Количественное определение двух антрациклинов может быть осуществлено после тонкослоиной хроматографии с упомянутой выше алюирутощей системой. соскабливантчем и вымыванием метанолом соответствующих зон с красным окрашиванием и конечным спектрометрическим определением при 496 нанометрах.Весь ферментационный бульон, в котором соединение П подвергается превращению в соединение РСЕ 24883 (н). фил ьтруют с-помощью диатомовой земли. Отфильтрованный красный мицелий экстрагируют смешивающимся с водой органическим растворителем. таким как метанол и другие низшие спирты. диоксан. ацетоннтрил и предпочтительно ацетон. Экстракты мицелия собирают концентрируют при пониженномферментационная жидкостью. устанавливают рН 8.0, затем экстрагируют невмешивающимся с водой органическим растворителем. таким как н-бутанол. хлороформ. д-ихлорметан или предпочтительно смесь дихпорметан-метанол в отношении 91. Органические экстракты содержат сое 1594динение РСЕ 24883 (П) вместе с соединен ем Щ и небольшими количествами других продуктов разложения.Органический экстракт КОНЦеНТПИРУЮТ при пониженном давлении досуха и остаток растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке силикагеля. стабилизированного буфером с рН 7.0. градиентом смеси дихлорметан-метанол-вода. Соединение (1) вымывают первым смесью в отношении 9550.25. затем соединение РСЕ 248-83 (Н) смесью в отношении 9 О 100.5. Из объединенных фракции после промывки водой, концентрирования до небольших объемов в присутствии н-пропанола. добавления эквивалента клористоводородной кислоаы и избытка н-гексана. получают преципитат чистого РСЕ 24883 (Н) в виде гидрохлорида (т)РСЕ 2488501 как свободное основание растворимо в полярных органических растворителях и водных спиртах, тогда как его гидрохлорид НО растворим в воде. но мало растворим в органических растворите ляк. Гидроклорид соединения СЕ 24883ИК-спектр КВт пики при следующих частотах 3400. 2971). 2920. 1610. 1580.1472. 1440. 1410. 1380. 1355. 1320. 1280. 1235. 12101110. 1080. 1060. 1030. 1010. 985. 955. 940. 920. 900. 890, 870. 860. 830. 810. 785. 755. 730. по. 540. 480. 450 и 415 смСпектр ЯМР на ядрах 1 Н (ЦМСО-ое. 200 МГЦ. 22 С) млнд 14.03 широкий синглет. 2 н. он-в. он-п. 7.6-7.0 (м. зн. н-т. н-2. н-з). 5.2 бм. 111.Н-т.4.96 (д. л 5.2 Гц. тн. ОН-1 З).4.92 (м. 1 Н. Н-7). 4.55 (м, 1 Н. 11414.51(дл. 4 6.0. 15.3 Гц. 1 Н. Н-В акс). 11.9 м. 2 Н, СН 2-2)и 1.14 (д. А - 6.0 Гц). ЗН. Сна-Б молекулярная формула С 27 НюМ 1 о-НСЬ гп/2 в О эквиваленте к свободному основанию 656 (М НУ 655 (М) и 410 М, соответствующие ЗГЛИКОНУ. Селективная жидкостная хроматография высокого давления позволяет разделить (два максимума с временем задержки 18.8 и 10.3 минут) два стереоизомерных спирта при С-13. присутствующих в образце синтетического 4-дезоксиг 13 дигидро-4новлением йода боргидридом натрия. Используя тот же метод жидкостной хроматографии высокого давления. получают соединение РСЕ 24883 (Н) как отдельный пик с временем задержки 19.3 минуты. соответствующим времени медленно движущейся составляющеи синтетического 13 дигидропроиаводного.. Метод жидкостной хроматографии высокого давления Колонка две секции ЯР сферисорб 5 30032 (618 3,11. разделение фаз Великобритания) размером - 150 х 4.5 мм. соединенные в ряд температура .45 С мобильная фаза д 0.05 М водного- КН 2 Р 0 а. подкисленного до рН 3.0 смесью НзРЩ-метанол в отношении 80 по объему подвижная фаза В метанол про-я вление изократное за 30 минут 42 ЪА 58 В) скорость потока 0,6 мл/мин детектирование 254 нанометра.Кислотный гидролиз соединения (Н)30 минут)дает красный осадок соответствующего агликона. тогда как сахарная компонента. а именно 3-амино-2 Задай-тетрадезокси-4-иод-Ь-ликсогексогексоза. присутствует в водной фазе и идентифицирована в сравнении с аутентичным образцом. полученным при кислотном гидролизе соединения (1).Цитотоксическую активность соедине- ния РСЕ 24883 испытывают Еп что на клеткак НеЧа и Р 388 в сравнении с соединением П) и доксорубициномвыявлено. что соединение (Н) не менее активное. чем гГ-деаокси 4-йододоксорубицин 4 и доксирубицинлейкоза Гросса. мышам линии СЗН вводят внутривенно инъекцию 2405 клеток на мышь. обрабатывают соединениями и изучают 24 часа после опухолевой инъекции.При оптимальной дозе соединение РСЕ 24883 (Н) более активное. чем доксорубицин. и такое же активное. как 4-дезокси-4 йододоксорубицин 0. с малой токсичностью. проявленной при активных дозах. Противоопухолевую активность соединения (П). оцененную как среднее время выживания обработанных животных над контрольными мышами. можно сравнить с активностью соединения (1) и доксорубицинв (табл. 2).Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Культуру микроорганизма Зтгертотусев реисепив штамм М 87 Р.1. (0 М 2444) выращивают 14 дней при 28 С на скошенном агаре следующей поддерживающей среды (СредаА) глюкоза 3. пивные дрожжи 1,2 МаС 0.1 Х КН 2 Р 04 0.05. СаСОз 0,1 М 93 О 4 000511 гезсд 41420 0000575 2 п 504 -7 Н 20 0000576 Со 5 О 45 Н 20 000051, агар 2 водопроводная вода доСпоры выращенной культуры собирают и суспендируют в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Этой суспензией засева 1594ют 60 мл жидкой питательной среды.содержащейся в 300 мл колбах Эрленмейера пивные дрожжи 0.15. пептон 0,5. СаМОа-4 Н 20 0.05. водопроводная вода до 100 мл. стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 120 С а течение 20 минут. рН этой среды после стерилизацииванные колбы встряхивают два дня при тем пературе 28 С на роторной мешалке при 250 об/мин. описывающей окружность диаметром 7 см. 1.5 мл культуры. выращенной описанным способом, высевают в 300 мл колбы Эрленмейера. содержащие 50 мл следующей биотрансформирующей среды дрожжевой экстракт 1.536. К 2 Р 04 0.25. глюкоза 1,5. водопроводная вода до 100 мл. рН 6.9. Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаае при 115 С в течение 20 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют к каждой стерилизованной колбе в нужной концентрации.Затем содержимое колб инкубируют при 2 ВС в условиях. описанных для фазы посева. в течение 24 часов. В это время в каждую колбу добавляют по 1,0 мл раствора соеди нения (Н) в стерилизованной воде в концентра ции. 5 мг/ мл. Встрякиваемые колбы инку бируют еще два дня и- получают ЮЭБ-оепре вращение соединения П в соединение (П). П р и м е р 2. Культуру микроорганизмана твердой питательной среде. как списано в примере 1. Споры трех скошенных агароя объединяют и собирают в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Получен ную таким образом суспензию высевают в 2-х л опрокидыввющиеся колбы с круглым дном. содержащие 500 мл посевной среды. описанной в-яримере 1. Колбу инкубируют 48 часов на роторной мешалке. вращающейся со скоростью 120 об мин и описывающей окружность диаметром 7 см. при температуре 2 ВС. Весь посеной материал инокулируют в 10 л бродильный чан из нержавеющей стали. содержащий 7.5 ел биотрансформнрутощей среды. описанной в примере 1 и сте рилизованной водяным паром при 120 С в .течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют в стерилизованный бродильный чан в соответствующей концентрации. Культуру выращивают при 28 С при помешивании с 230 об мин и аэрации потоком воздуха со скоростью 1 л/л среды Умин. Через 48 часов добавляют субстратноесоединение в концентрации,описан-ной в примере 1. и после инкубирования культуры в течение 3-х дней получают бШЪ-ную конверсию соединения П) в соединение (Н).П р и м е р 3. Цельное сусло (5 л из ферментации. полученной по примеру 2. фильтруют с использованием 2 диатомовой земли в качестве фильтра. Влажн ый осадок на фильтре экстрагируют ацетоном (3 л). После фильтрации проводят две дополнительных экстракции ацетоном для достижения полного выделения красных пигментов. Объединенные ацетоновые экстракты концентрируют при пониженном давлении и концентрат (1 л) объединяют с профильтрованным бульоном и исчерпывающе экстрагируют при рН 8.0 смесью дихлорметаи-метанол в отношении 9 1. Органический экстракт. содержащий соединения П и (Н) с теми же продуктами распада. концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток. растворенный в диклорметане. кроматографируют на колонке силикагеля. стабилизированного буфером с рН 7.0(М 15 фосфатный буфер. градиентом смеси диклорметан тетанол-вода. После вымывания некоторых продуктов распада зпюируЮТ соединение СМВСЬЮ В ПНОШЕНИИ 9550.25 с последующим злюированием соединения РСЕ 24883 Н смесью в отношении 901005. 7Из объединенных фракций после промывки водой. концентрации до небольшого объемгц в присутствии н-пропанола, добавЛВНИЯ ЙДНОГО ЭКВИЕЗЛВНТЭ ХЛОПИСТОВОДО родной кислоты и избытка н-гексанаполучают чистое соединение РСЕ 24883 (Н) 0.30. впав-ныл выход. в Форме гидрохлорида(т.пл. 2 О 0 С. разлагается). Повторяя процесс, выделяют также нетрансформированде соединение (21.13 г. 26) в виде гидрохлорида п р и м-е р 4. Образец соединения РСЕ 24883 (П) 200 мг растворяют в 0.2 н. водной хлористоводородной кислоте (50 мл) и нагревают 30 минут при 100 С. Кристаллический красный осадок (1112 г) агпикона собирают фильтрацией. промывают водой и сушат. Масс-спектр т/е 416 (МЧ. Агликон идентифицирован как 13-)-дигьщроадриамицинон сравнением с аутентичным образцом. - Фцормула изобретениязаключающийся в том. что штамм Зтгертогпусев реисеиив ВЗМ 2444 культивируют в аэробных условиях в питательной среде. содержащей источники азота и углерода и минеральные соли. в присутствии 4 -дезо кси 4-йододокси руби цина в форме его хпоргидрата в конечной концентрации 0.1 мг/млгсреды при температуре 2730 С. полученную кул ьтуральную жидкость разде ляют. отделенный мицелий экстрагируютацетоном. а жидкую фазу смесью дикпормг тана и метанола в объем нон соотношении 91 при р-Н 8.0. далее полученные экстрайты объединяют и концентрируют при пониженном давлениидо сухого состояния.. ЗЗТВМ КОНЦВНТВЗТ растворяют В диклорме твне и хроматографии/ют на колонке из силикагеля. забуференного до рН 7.0. алюируют последователь-но смесью дихлорметана. метанола и воды при объемномсоотношении 955 О.25-и 901005 соответ ственно. полученн ый второй эл юат концентрируют в присутствии н-пропанопа. выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата.а) доза, дающая 50 снижен ными животнымиив числа клеток в сравнении с контрольными необработа н Ь) КЛЕТКИ ЭПИТЗЛИОИДНОЙ КЗПЦИНОМН ШВИ человека