Пробиотический штамм Lactobacillus brevis 4 LB

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 35/74 (2006.01) 12 1/225 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ конкурируют с целым рядом лекарственных средств антибактериальной направленности. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенной и патогенной микрофлоры,,,, ,. Зоны угнетения роста тест-штаммов, мм- 35,- 25,30,- 20,- 13,- 25. Обладает антиоксидантной, лизоцимной, антилизоцимной,протеолитической активностью. Обладает свойством адгезии с показателем 2,9. Устойчив к секретам желудочно-кишечного тракта и к ряду антибиотиков. Штамм 4 рекомендуется использовать в разработке пробиотического препарата для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника и гепатита.(72) Абитаева Гуляим Каиркеновна Ануарбекова Сандугаш Сакеновна Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Изобретение относится к биотехнологии, к получению штамма, обладающего широким спектром пробиотического действия. Новый штамм бактерии вида 4 , выделенный из кумыса домашнего, обладает пробиотическими свойствами,которые Изобретение относится к биотехнологии, к получению штамма с пробиотическими свойствами,обладающего профилактическим и лечебным действием при дисбактериозе кишечника и гепатите. Известен штамм бактерий-13,используемый для приготовления пробиотических препаратов и продуктов питания(Патент РФ 2190015). Штамм лактобактерий -ВА 13 выделен из соскоба слизистой желудка здорового взрослого человека. Обладает хорошо выраженной антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам,а именно стафилококкам, клебсиеллам, хеликобактериям. Штамм обладает устойчивостью к ряду антибиотиков цефокситину,цефотетану,тетрациклину,метронидазолу,тейкопланину,ванкомицину. Недостатком является то, что нет данных об антагонистической активности к различным видам лактобацилл, устойчивости к секретам желудочнокишечного тракта и корригирующего действия при гепатите. Задача настоящего изобретения заключается в получении отечественного пробиотического штамма для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника и гепатита. Технический результат достигается предлагаемым штаммом 4 ,выделенного из кумыса домашнего Акмолинской области. Заявляемый штамм приобрел и обладает ярко выраженной антимикробной активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Пробиотический штамм 4 обладает высокой антагонистической активностью к ряду условнопатогенных и патогенных микроорганизмов,,, ,, . Зоны угнетения роста тестштаммов, мм- 35,25,- 30,20,- 13,- 25. Штамм не ингибирует размножение пробиотических лактобацилл и биосовместим с лактобациллами других видов, в том числе, выделенных из желудочно-кишечного тракта здоровых людей, что делает возможным включение его в лекарственные препараты для лечения кишечных заболеваний. Обладает антиоксидантной, лизоцимной, антилизоцимной,протеолитической активностью, особенностью является биосовместимость с разными видами лактобацилл. Имеет среднюю степень адгезивности с показателем адгезии 2,9. Его преимуществом является высокая технологичность он способен расти на питательных средах для лактобацилл различного состава без добавления дополнительных факторов роста Штамм устойчив к замораживанию и оттаиванию при добавлении 20 глицерина и 10 сахарозы,сохраняет жизнеспособность и биологические свойства после сушки при помощи лиофилизации. В молоке сохраняет жизнеспособность в течение 1 года при хранении в условиях заморозки -30 С,2 месяца и более при хранении в условиях 4 С. Одним из преимуществ является коррегирующее действие воспаления печени. Штамм 4 обладает устойчивостью к аминогликозидам и гликопептидам, что позволяет осуществлять санацию организма от патогенных микроорганизмов и одновременно нормализовать микробиоценоз организма человека после тяжелых инфекций и лечения антибиотиками. Достижения технического результата позволяют получить пробиотический штамм 4 , обладающий широким спектром пробиотических свойств для профилактики и лечения дисбактериоза и гепатита. Штамм(Патент РФ 2412239), который оказывает избирательное ингибирующее действие на рост протея и клебсиелл, способствует быстрому восстановлению содержания в кишечнике лактобацилл, но имеет низкий показатель антагонистической активности. В связи с вышеизложенным, поиск штамма 4 с широким спектром пробиотического потенциала, восстанавливающих нормальный биоценоз кишечника и функции печени, имеет важное значение при профилактике и лечении дисбактериоза кишечника и гепатита. Полученный нами в результате скрининга пробиотический штамм предназначен для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника и гепатита. Выделение чистой культуры Штамм был выделен из кумыса домашнего Акмолинской области. Для выделения молочнокислых бактерий, исследуемые образцы засевались в обогащенные среды МРС-1 производства. . следующего состава (г/л) протеозопептон - 10,дрожжевой экстракт - 5, мясной экстракт - 10,глюкоза - 20, твин-80 - 1, аммония цитрат - 2, натрия ацетат - 5, магния сульфат - 0,10, марганца сульфат 0,05, натрия гидрофосфат - 2,6,5,инкубировались при 37 С двое суток. Далее, пробы из жидкой среды высевали на плотные селективные среды МРС-4 производства.с компонентами (г/л) протеозопептон - 10,дрожжевой экстракт - 5, мясной экстракт - 10,глюкоза - 20, твин-80 - 1, аммония цитрат - 2, натрия ацетат - 5, магния сульфат - 0,10, марганца сульфат 0,05, натрия гидрофосфат - 2, агар-агар - 12,6,5. Посевы инкубировали в термостате при 37 С в течение 48 часов. Выросшие колонии отсевали в пробирки со скошенной питательной средой МРС-4 и инкубировались при 37 С в течение 48 часов. Принадлежность выросших микроорганизмов к родуустанавливали на основе их микроскопии морфология клеток, подвижность, 30440 отсутствие или наличие спор, тинкториальные свойства наличие каталазы рост на питательном агаре. Штамм 4 характеризуется следующими морфологическими, культуральными,биохимическими и другими биологическими признаками. Морфо-культуральные свойства Клетки штамма 4 грамположительные бактерии средних размеров,имеют палочковидную форму с закругленными концами, располагаются по одной или в виде коротких цепочек, неподвижны. Капсулы, фимбрии,жгутики, споры не образуют. При росте в жидкой среде МРС образуется осадок белого цвета, воздушный с более плотным центром в виде пуговки, наблюдается помутнение среды. Отмечается характерный кисло-молочный запах. На МРС-агаре колонии белого цвета, круглой формы, выпуклые, непрозрачные, блестящие,сочные, влажные, края ровные, поверхность гладкая, пигментов не образуют. Размер варьирует от 0,1 до 1 мм. Отмечается характерный кисломолочный запах. Идентификация выделенных культур Работа по видовой идентификации лактобактерий была проведена с помощью молекулярно-биологических методов на основе анализа гена 16 . Геномная ДНК выделялась из чистых культур молочнокислых бактерий с набором для выделения,согласно инструкции производителя. При выделении ДНК измеряли концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометрапри длине волны 260 и 280 нм. Реакция ПЦР была выполнена с универсальными праймерами 8 5 - -3 и 806 - 5 С в общем объеме 30 мкл. Далее проводили очистку ПЦР продуктов от не связавшихся праймеров, используя ферменты. Реакцию секвенирования проводили с применением 3.1( ) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 37301( ). Полученную нуклеотидную последовательность сопоставляли с нуклеотидными последовательностями международных баз данных. Культура,выделенная из национального напитка - кумыса, обладающая пробиотическим Определение антагонистической активности Антагонистическую активность лактобацилл по отношению к тест-культурам, ,,,,изучали методом диффузии в агар. Готовят суспензию клеток суточных культур молочнокислых бактерий в количестве 1 млд/1 мл (по стандарту бактериальной мутности) и наносят на поверхность чашки(можно вносить в расплавленную и остуженную среду 0,1 мл суспензии молочнокислых бактерий, перемешать и разлить в чашку Петри). Далее вырезаются лунки с верхом диаметром 10 мм и заполняются культурами тест-штаммов (0,1 мл). Через сутки замеряют диаметр зоны отсутствия роста бактерий. Антагонистическая активность исследованных культур считалась нулевой при ширине зоны отсутствия роста тест-штаммов до 1,0 мм, низкой при 1,1- 4,9 мм, средней - при 5,0-8,9 мм, высокой при 9,0 мм и более. Результаты Диаметр зон подавления роста тест-культур, мм Показатели антагонистической активности к данным тест-штаммам высокие. Определение адгезивной активности 3 Адгезивность штаммов изучали в системена формалинизированных эритроцитах человека 0(1)по методике В. Брилиса. Использовали 18 часовые культуры микроорганизмов, выращенные на МРС-бульоне при температуре 37 С в стационарных условиях и отмытые от среды выращивания буферным раствором 2 раза по 10 мин - 1 500 об/мин. Подсчет концентрации эритроцитов производили в камере Горяева под световым микроскопом. Концентрацию суспензии микробных клеток определяли по оптической плотности 530 1,0 или по ОСО стандарту мутности 10 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Затем смешивали по 0,5 мл суспензии эритроцитов и микробных клеток,инкубировали в течение 45 минут при температуре 37 С, периодически встряхивая. Делали мазки по типу кровяных. Окрашивали по РомановскомуГимза и просматривали под световым микроскопом. Определяли количество бактерий, прикрепившихся к одному эритроциту. Производили подсчет не менее 100 эритроцитов в не менее чем в 5 полях зрения. Определяли средний показатель адгезии(СПА), коэффициент адгезии. Средний показатель адгезии определяли по среднему числу микробов,прикрепившихся к поверхности одного эритроцита,подсчитывая все имеющиеся эритроциты в 5 полях зрения, но не менее 50 эритроцитов. Адгезивность считают нулевой при СПА от 0 до 1,0, низкой - 1,012,0, средней - 2,01-4,01, высокой - свыше 4,0. Из общего числа учитываемых эритроцитов вычисляли процент эритроцитов. Адгезивная активность у 4 средней степени с показателем адгезии 2,9. Изучение устойчивости к антибиотикам Чувствительность выделенных культур к антибиотикам определяли методом стандартных дисков в соответствии с Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04, Москва, 2004 г.) Чувствительность определяли к 8 антибиотикам амоксициллину(Тс), стрептомицину , ванкомицину ,цефазолину . Из чистых агаровых культур готовили суспензию, плотностью по стандарту мутности в 10 ЕД, затем полученную взвесь разводят повторно еще в 20 раз. В чашки Петри на поверхность агаризованной среды МРС-5 наносили 1 мл микробной суспензии и покачиванием равномерно ее распределяли, а избыток удаляли пипеткой. Чашки подсушивали при комнатной температуре 10-15 мин, стерильно раскладывали диски на поверхность среды не более 5-6 штук на одну чашку. Через сутки учитывали результаты путем измерения зоны задержки роста микроба, с учетом диаметра самого диска. По чувствительности бактерии были разделены на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые. Результаты антибиотикорезистентности штамма представлены в таблице 2. Культура резистентна к канамицину,стрептомицину и ванкомицину. Таблица 2 Антибиотикорезистентность 4 Устойчивость к действию желчи Минимальные ингибирующие концентрации определяют в пробирках с гидролизованным молоком, содержащим бычью желчь (20, 30, 40). Кинетику роста и жизнеспособность нужно оценивать на протяжении 24 ч в сравнении с начальными цифрами. Значениябыли приведены до 8,0 в соответствии с экспериментальными протоколами, разработанными для лактобацилл. Фактическижелчи и поджелудочного сока, выделяемого в кишечник,составляет примерно 8,0. Окончательное считывание результата осуществляется через 24 и 48 ч инкубации при температуре 37 С. Штамм 4 в присутствии 20 желчи имеет показатель жизнеспособности 1,8105 КОЕ/мл. Устойчивость к последовательному действию кислоты и желчи. Имитацию транзита по желудочно-кишечному тракту проводят по методикеи соавт. (2001). Культуры вначале инкубируют при 2,0-3,0 в физиологическом растворе в течение 1-2 ч, затем 4 помещают в 1 желчный бульон . Начальная концентрация культуры микроорганизма должна составлять 107/мл (., 1987). Штамм 4 сохраняет жизнеспособность(105 КОЕ/мл) при последовательном действии кислоты и желчи. Устойчивость к хлориду натрия Культуры молочнокислых бактерий засевают в количестве 1 петли на 8-10 мл гидролизованного молока ( 6,8-7,0) с различным содержанием соли -(2, 4, 6). Инкубация при 37 С - 2 суток. После инкубации отмечают характер роста исследуемых культур и их количество. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально(после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности. Штамм 4 устойчив к действию 2-6 . Оценка биосовместимости методом совместного культивирования Глушановой Н.А. на плотной питательной среде МРС Суточную культуру, выращенную на жидкой питательной среде и стандартизированную по стандарту мутности, наносят на поверхность плотной питательной среды бактериальной петлей диаметром 3 мм. После впитывания капли, отступив 1-2 мм от ее края, на поверхность той же среды наносят в том же объеме каплю другой испытуемой культуры,которая растекаясь,примерно наполовину покрывает первую каплю. В наложенной части культуры развиваются при взаимном присутствии, конкурируя друг с другом. После подсыхания второй капли чашки с посевами переворачивают вверх дном и инкубируют при 3739 С. Каждый опыт ставят в двух повторностях,меняя положение культур (с целью исключения влияния последовательности наслоения капель культур на характер роста в зоне совместного культивирования). Контролем служит капля одной и той же культуры, наслоенные друг на друга по описанной выше методике. Учет результатов проводят через 24 и 48 часов после начала инкубации. При задержке роста одной их исследуемых культур взаимоотношения между ними рассматриваются как антагонистические, а сами культуры относят в категорию бионесовместимых. Культуры считаются биосовместимыми в случае обнаружения полного слияния пятен, или усиления роста исследуемых штаммов в зоне совместного культивирования. Если одна из культур в зоне совместного культивирования выходит наверх, подавляя рост второй культуры,независимо от последовательности нанесения, такой вариант расценивают как слабый антагонизм. Наличие хорошо выраженной зоны угнетения(задержки рост) одной культуры по периферии пятна другой испытуемой культуры расценивают как признак сильного антагонизма. Опыт проводят в троекратной повторности. Штамм 4 биосовместим с 8 штаммами бактерий рода , которые представлены видами , , , . Также штамм 4 обладает антиоксидантной, лизоцимной, антилизоцимной,протеолитической активностью, коррегирующим действием при гепатите. Таким образом, штамм 4 обладает широким спектром пробиотических свойств, имеющих значение при коррекции нарушенного кишечного биоценоза и гепатита. Изобретение представляет собой способ получения штамма с пробиотическими свойствами,обладающего профилактическим и лечебным действием при дисбактериозе кишечника и гепатите. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Пробиотический штамм 4, депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под номером -0610,используемый в качестве основы бактериального препарата для профилактики и лечения дисбактериоза кишечника и гепатита.