Способ гарантийного хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических групп, основанного на контактно-сорбционном обезвоживании Таган и Алтай сорбентами

(51) 12 1/04 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Предлагаемое изобретение представляет инновационный способ гарантийного хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических групп, основанного на контактносорбционном обезвоживании Таган и Алтай сорбентами. Задача изобретения - получение надежного способа хранения коллекционных субкультур различных таксономических групп микроорганизмов,на основе отечественных сорбентов для гарантийного сохранения жизнеспособности,основных биологических свойств и увеличения длительности выживания микроорганизмов. Технический результат, достигается за счет использования отечественных сорбентов,основанных на механизме контактно-сорбционного обезвоживания (КСО) коллекционных и других субкультур различных таксономических групп микроорганизмов для их гарантийного хранения. Предлагаемый способ позволяет гарантированно сохранять коллекционные, производственные и рабочие субкультуры микроорганизмов,без пересева в течение длительного времени (12-ти и более месяцев, срок наблюдения).(72) Арыкпаева Умыт Тулубековна Динкаева Карашаш Амангельдиновна Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ГАРАНТИЙНОГО ХРАНЕНИЯ СУБКУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП,ОСНОВАННОГО НА КОНТАКТНОСОРБЦИОННОМ ОБЕЗВОЖИВАНИИ ТАГАН И АЛТАЙ СОРБЕНТАМИ(57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к получению нового способа хранения коллекционных,производственных и рабочих субкультур микроорганизмов на адсорбентах Таган и Алтай в качестве носителей для контактно-сорбционного обезвоживания. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к получению нового способа хранения коллекционных,производственных и рабочих субкультур микроорганизмов на адсорбентах Таган и Алтай в качестве носителей для контактно-сорбционного обезвоживания. Известен способ хранения культур микроорганизмов в физиологическом растворе с волокнами капрона, или полипропилена, или лавсана, или вискозы после внесения суспензии микроорганизмов. (Патент 2008348). Известный способ хранения микроорганизмов,включающий внесение суспензии микроорганизмов в физиологический раствор. Суспендируют культуры в защитной среде с последующим контактно-сорбционным обезвоживанием коммерческими сорбентами. Предварительно вводят в физиологический раствор волокна капрона, или полипропилена, или лавсана, или вискозы в количестве 15-25 г/л и вносят суспензии микроорганизмов концентрации 0,5106 - 7,5106 клеток/мл и досушивают при комнатной температуре. Недостатки известного способа грамположительные, например,могут храниться в разработанной среде только в течение 1-3 месяцев, при этом выживаемость составляет только 30, рост наблюдается в разведении до 103. Грамотрицательныеибактерии, дрожжеподобные грибыи спорообразующие аэробы в предлагаемой среде хранятся до 12 месяцев,выживаемость составляет 80-96 , визуальный рост исследуемых культур отмечен в разведении до 10-6. Предлагаемое изобретение представляет инновационный способ гарантийного хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических групп, основанного на контактносорбционном обезвоживании Таган и Алтай сорбентами. Задача изобретения - получение надежного способа хранения коллекционных,производственных и рабочих субкультур различных таксономических групп микроорганизмов, на основе отечественных сорбентов для гарантийного сохранения жизнеспособности,основных биологических свойств и увеличения длительности выживания микроорганизмов. Технический результат, достигается за счет использования отечественных сорбентов,основанных на механизме контактно-сорбционного обезвоживания (КСО) коллекционных и других субкультур различных таксономических групп микроорганизмов для их гарантийного сохранения. Предлагаемый способ позволяет гарантированно сохранить коллекционные и рабочие субкультуры микроорганизмов, без пересева в течение длительного времени (12-ти и более месяцев, срок наблюдения). Достижение технического результата позволяет получить инновационный способ длительного 2 хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических групп на адсорбентах Таган и Алтай, без дополнительного пересева, позволяющее удлинить сроки хранения и жизнеспособность. Ниже приведены отобранные 3-й и 6-й варианты из разработанных шести вариантов контактносорбционного обезвоживания (КСО) адсорбентами,этапы подготовки и использования для хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических групп. 3-й вариант 3.1. Адсорбент в количестве 200 мг стерилизуют сухим жаром в течение 1,5-2 часов при 170-180 С в закрытых пробирках, с обязательным контролем стерильности 3.2. Выращенную культуру 250 мкл 1010 КОЕ/мл суспензии микроорганизмов смешивают с молоком для бактериологических целей в концентрации 10, объемом 250 мкл 3.3. Стерильный адсорбент в количестве 200 мг пропитывают суспензией бактерий, содержащей не менее 11010 КОЕ/мл, и высушивают на воздухе или под вакуумом в запечатанных пробирках 3.4. Культуры помещают в холодильник при температуре 4 С. 6-й вариант 6.1. Адсорбент в количестве 200 мг в закрытых пробирках стерилизуют автоклавированием 30 мин при 1,1 атм. 6.2. Выращенную культуру 250 мкл 1010 КОЕ/мл суспензии микроорганизмов смешивают с молоком для бактериологических целей в концентрации 10,объемом 250 мкл в пробирку со стерильным адсорбентом в количестве 200 мг, закрывают стерильными резиновыми пробками 6.3. Оставляют при комнатной температуре до заметного высыхания 6.4. Пробирки хранят в холодильниках при температуре 4-5 С. Исследования проводились с 50 коллекционными,промышленно-ценными штаммами микроорганизмов различных таксономических групп,принадлежащих к представителям прокариотических и эукариотичеких клеток 1. Коллекционные,промышленно-ценные штаммы группы бактерий рода 3000283100299003060031-66330065/-90067. Л 20472.537047382410474- 5230210 2. Коллекционные,промышленно-ценные штаммы группы бактерий 26650033 .17700382210059 ТА 980162 СТФ-1/560047109005246(-)0056 009421700956-25009830306230317. 3803291090434. 16043640437 5. Коллекционные,промышленно-ценные штаммы мицелиальных грибов 008710089-20091.013410139 50140 1101410229 В -06 0245 Результаты количественной и качественной оценки эффективности хранения 50 коллекционных,промышленно-ценных микроорганизмов различных таксономических групп на Таган и Алтай сорбентах,через 3, 6, 12 месяцев позволили нам установить существенные преимущества по сравнению с традиционными способами субкультивирования. Разработаны и испытаны 6 вариантов контактносорбционного обезвоживания адсорбентами, все они показали эффективность их применения, которое оценивалось с учетом максимального показателя жизнеспособности и основных биологических свойств. В качестве сорбента были взяты отечественные препараты Таган, Алтай сорбенты(ТОО Сорбент, г. Усть-Каменогорск, РК) на первом этапе хранения. Затем для КСО были использованы адсорбенты Адсорбикс, Энтеросгель,Лактофильтрум и белая глина. Таблица 1 Количественная характеристика микроорганизмов 6-ти месячного хранения микроорганизмов на 6-м варианте КСО Таган сорбентом, Энтеросгелем и Адсорбиксом Таксономическая группа МКБ (таган сорбент) ТС МКБ (адсорбикс) Ас Дрожжи (таган сорбент) ТС Дрожжи (адсорбикс) Ас Бактерии (таган сорбент) ТС Бактерии (энтеросгель) Эг Грибы (таган сорбент) ТС Грибы (адсорбикс) Ас Бациллы (таган сорбент) ТС Бациллы (адсорбикс) Ас Результаты исследования количественной оценки микроорганизмов после 6-ти и 12-ти месячного хранения на 3-м и 6-м вариантах КСО с использованием адсорбентов Таган, Адсорбикс,Энтеросгель показывают хорошую жизнеспособность и сохраняемость от 1,00,5 до 4,30,3108 КОЕ/мл. Лучшую жизнеспособность и сохраняемость в количественном отношении обеспечивает 6-й вариант КСО адсорбентами для бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей, бацилл и МКБ. Необходимо отметить, что микроорганизмы на сорбентах Таган, Адсорбикс, Алтай сохранили жизнеспособность с улучшением морфологокультуральных свойств через 3, 6, 12 месяцев хранения. На рисунке 1 показана культуральная характеристика лактобактерий после высева с адсорбентов Адсорбикс, Таган и субкультуры Результаты Рост культур после хранения на адсорбентах (М) 108 (КОЕ/мл) 4,30,3 3,30,5 2,90,6 2,90,7 3,10,4 3,20,4 3,20,4 2,90,3 2,50,4 0,60,3 0,80,3 1,00,5 3,1 0,5 3,50,3 3,90,3 штаммаБ 0003 на плотную среду . Культуральная характеристикаБ 0003 при сравнении посева с адсорбентов и субкультуры хорошо отмечается отличие роста колоний, высеянных с адсорбентов более крупные,хорошо сформированные и в большем количестве. 3 Это подтверждает наличие хороших условий хранения на адсорбентах по отношению к традиционным субкультурам лактобактерий. Характер роста на рисунке 1 определен какхороший типичный рост, такой рост отмечен из 3-го и 6-го вариантов КСО адсорбентами лактобактерий у всех 10 штаммов. На рисунках 2 и 3 показаны морфологическая и тинкториальная характеристикаМ 0003 после реактивации с адсорбентов Рисунок 3 - Морфологическая и тинкториальная характеристикаМ 0003 с субкультуры При сравнении особенности роста на плотных средах и препаратов, окрашенных по методу Грама видно,что культурально-морфологическая характеристикаМ 0003 и остальных штаммов с адсорбентов значительно отличается по культурально-морфологическим характеристикам от традиционных субкультур. Показатели морфологических свойств одних и тех же штаммов заметно улучшились так микроскопическая картина отличается, четким окрашиванием по Граму,с адсорбентов грамположительные как свежевыделенные культуры,с обычных субкультур грамотрицательные (рисунки 1, 2 и 3) В большинстве случаев тинкториальные свойства, хранившихся штаммов на адсорбентах были более выражены, как у вновь выделенных культур по сравнению с окрашенными препаратами,сделанных с субкультур этих же штаммов. Исследования с первыми и последующими образцами проводились с вышеперечисленными 50 коллекционными штаммами микроорганизмов различных таксономических групп, принадлежащих к представителям прокариотических и эукариотичеких клеток. Образцы,которых заложены на 3 года хранения. В первых образцах определяли способность сохраненных микроорганизмов через 12 месяцев с использованием Таган и Алтай сорбентов, после внесения суспензии и протекторной среды в объеме 1000 мкл каждого штамма на 3-й и 6-й варианты КСО адсорбентами. Таблица 2 Количественная характеристика микроорганизмов через год хранения КСО Таган и Алтай сорбентами МКБ (таган сорбент) ТС МКБ (алтай сорбент) АС Дрожжи (таган сорбент) ТС Дрожжи (алтай сорбент) АС Бактерии (таган сорбент) ТС Бактерии (алтай сорбент) АС Бациллы (таган сорбент) ТС Бациллы (алтай сорбент) АС Учитывая, что суть метода заключается в обезвоживании микроорганизмов при контакте с сорбентом, в результате чего микроорганизмы теряют воду, и метаболические процессы резко замедляются, был отработан оптимальный объем суспензии и протекторной среды для проведения КСО препаратами сорбентов. Результаты Рост культур после хранения на адсорбентах (М) 108 (КОЕ/мл) 108 (КОЕ/мл) 3,60,5 3,60,3 3,60,5 2,80,5 2,90,3 3,00,4 3,80,4 3,40,3 3,00,6 4,00,4 3,70,3 3,40,5 При испытании различных вариантов КСО различными сорбентами также были отработаны и оптимизированы следующие положения- отработан объем суспензии и защитной среды с 1000 мкл на начальных этапах работы до 500 мкл(250 мкл суспензии микроорганизмов 250 мкл 10 молока) при внесении в адсорбент образуется минимум жидкости, поэтому меньше времени уходит на сушку при использовании отобранных вариантов- количество адсорбента 200 мг является наиболее оптимальным для поглощения 500 мкл жидкости или соотношение адсорбента и суспензии с защитной средой при любых других объемах составляет 12,5 Результаты изучения морфолого-культуральных свойств группы бактерий, группы ,мицелиальных грибов и дрожжей с адсорбентов Лактофильтрум, белая глина, Таган и Энтеросгель, а также Адсорбикс для мицелиальных грибов и дрожжей через 6 и 12 месяцев хранения позволяют говорить о хорошей жизнеспособности и сохраняемости субкультур на всех использованных для хранения сорбентах. При этом адсорбент Лактофильтрум был использован без протекторной среды, суспензии для перечисленных культур микроорганизмов добавлялись в адсорбент без молока. На всех адсорбентах Лактофильтрум, белая глина,Таган и Энтеросгель морфологокультуральные свойства микроорганизмов были типичными и соответствовали исходным данным. Полученные результаты свидетельствуют, что для групп бактерий, , мицелиальных грибов и дрожжей при отборе адсорбентов для хранения,которые содержат лигнин и каолин, как в данном случае Лактофильтрум и- белая глина,особого значения не имеют. Результаты хранения лактобактерий на адсорбентах Лактофильтрум и белая глина,показали, что ни один штамм лактобактерий не сохранился на этих адсорбентах, хотя другие таксономические группы микроорганизмов успешно выжили на них. Лактрофольтрум был использован для контактно-сорбционного обезвоживания в отличие от других сорбентов без протекторной среды, т.е. без молока. Этим можно объяснить гибель молочнокислых бактерий в препаратах адсорбента Лактофильтрум, а белая глина оказалась не приемлемой как адсорбент для МКБ. Из полученных результатов можно констатировать, что лактобактерии наиболее чувствительные к адсорбентам, чем другие микроорганизмы, поэтому могут служить как индикаторные микроорганизмы при отборе адсорбентов для хранения, которые содержат лигнин и каолин, как в данном случае Лактофильтрум и- белая глина. С учетом изложенного, при разработке нового способа хранения субкультур,можно констатировать следующее- Проведенное изучение качественных и количественных показателей 50 коллекционных штаммов микроорганизмов бактерий, дрожжей,мицелиальных грибов, бацилл, лактобактерий,заложенных на хранение КСО адсорбентами обеспечивают хорошую их жизнеспособность и сохранность- Проведенный сравнительный анализ этапов подготовки каждого из 6-ти вариантов с учетом доступности, просты в использовании и менее затратных вариантов закладки на хранение КСО адсорбентами, позволили отобрать для дальнейших исследований 3-ий и 6-ой вариант- Контактно-сорбционное обезвоживание Таган и Алтай сорбентами позволяет консервировать и сохранять различные группы микроорганизмов без потери ими своих основных биологических свойств- Лактобактерии могут быть использованы в качестве индикаторных микроорганизмов при отборе адсорбентов для хранения, которые содержат лигнин и каолин, не приемлемые для использования при хранении лактобактерий.- Для групп бактерий, , мицелиальных грибов и дрожжей при отборе адсорбентов для хранения, которые содержат лигнин и каолин,особого значения не имеют.- Предпочтительнее использовать в качестве протекторной среды минимальные при КСО адсорбентами, поскольку в них процессы метаболизма микроорганизмов замедляются за счет обезвоживания и поэтому промежутки между пересевами и сроки хранения субкультур на адсорбентах удлиняются.- Для уменьшения высыхания культур необходимо использовать пробирки с завинчивающимися крышками или резиновые пробки (если нет необходимости высушивания).- Для уменьшения скорости метаболизма микроорганизмов, культуры необходимо хранить в бытовом холодильнике при температуре 5-8 С(кроме условий, хранения при других показателях). Таким образом, контактно-сорбционный метод с использованием определенных препаратов адсорбента, позволяет консервировать и длительно сохранять субкультуры различных групп микроорганизмов без потери ими своих основных биологических свойств. Это дает возможность использовать КСО препаратами адсорбентов для хранения субкультур микроорганизмов различной таксономической группы в коллекционном деле, а также в практических и производственных лабораториях. Круг применения этого инновационного способа хранения субкультур в дальнейшем будет расширено по мере проведения дополнительных исследований,заложенных образцов на адсорбентах на 3 года хранения. Контактно-сорбционное обезвоживание сорбентами Таган и Алтай с протекторной средой,позволяет без пересева сохранять субкультуры различных групп микроорганизмов и без потери ими своих основных биологических свойств(морфологических, культуральных, биохимических изученные через 3, 6 и 12 месяцев хранения) Контактно-сорбционное обезвоживание препаратами адсорбентов Алтай и Таган, не требует специального оборудования,значительных физических и экономических затрат. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ гарантийного хранения субкультур микроорганизмов различных таксономических 5 групп, включающий суспендирование культуры в защитной среде с последующим контактносорбционным обезвоживанием коммерческими сорбентами и досушиванием при комнатной температуре в течение 48-72 часов, отличающийся тем, что контактно-сорбционное обезвоживание целевого продукта проводят Таган или Алтай сорбентами в защитной среде, используют молоко при массовом соотношении 2,51 суспензии микроорганизмов и сорбента, с последующим хранением в бытовом холодильнике при температуре 5-8 С.