Штамм мицелиального гриба Trichoderma harzianum F-RKM-0551- продуцент целлюлазы

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ достаточно высокой целлюлозолитической активностью. Штамм был выделен на плотной питательной среде Гетчинсона, методом серийных разведений. Образцы древесины сосны отобраны на территории Акмолинской области в 2012 г. Усиление свойств целлюлозолитической активности штамма 7 проведено с применением обработки нитрозометилмочевиной,ультрафиолетового и рентген облучения. Культивирован на агаризованной питательной среде Чапека при температуре 20 - 25 С в течение 7 сут. Идентифицирован с использованием определителя С.Р. Шварцман и др. Флора споровых растений Казахстана. Штамм гриба 7. на основании результатов анализа патогенности депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под 0551.(72) Оспанкулова Гульназым Хамитовна Нечай Наталья Леонидовна Каманова Светлана Георгиевна Тоймбаева Дана Болатовна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт переработки сельскохозяйственной продукции(54) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА 0551 ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии,микробиологии касается производства ферментных препаратов и представляет собой новый штамм 0551 продуцент целлюлаз. Технической задачей изобретения является получение штамма-0551 - продуцента целлюлазы и обладающего Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой промышленности,сельском хозяйстве,касается производства ферментов и представляет собой штамм - продуцент целлюлаз. Известны штаммы, при культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу,бета-глюкозидазу, бета-ксилозидазу, бета-глюканазу и ламинариназу (Патент РФ 2057179, кл. С 12 9/42,1996 г.). Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно целлюлаза 5,0 Е/мл ксиланаза - 125,0 Е/мл бета-глюкозидаза 20,0 Е/мл бета-ксилозидаза - 36,0 Е/мл бетаглюканаза - 0,95 Е/мл и ламинариназа - 1,25 Е/мл. Недостатком является низкая активность комплекса ферментов, что делает нецелесообразным их практическое применение. Известно,что наиболее активными продуцентами целлюлаз являются штаммы мицелиальных грибов рода . С целью повышения их способности к продукции и адаптации к более дешевым средам были получены различные мутантные и рекомбинантные штаммы(.). Мутант .80 при непрерывном культивировании на питательной среде с 8 целлюлозы и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед/мл(см. описание к патенту США 4472504, М. кл. С 12 9/42, 1984 г.).- активность целлюлазного комплекса,определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации(,.., .59, 2, .257-268). Известен мутант 43803,который, вследствие частичного уменьшения катаболитной репрессии биосинтеза, обеспечивает высокую продуктивность целлюлаз и высокий (до 10 ед/мл ) уровень активности целлюлазы при культивировании на среде с лактозой (см. описание к патенту ГДР 291673, М.кл. С 12 9/42, 1991 г.). Кроме того, известен штамм мицелиального гриба-1 ВКМ 3634, полученный с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры 6 а с применением ультрафиолетового облучения. Штамм обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз,что создает возможность получения полного комплекса ферментов,а также,при необходимости,индивидуальных ферментов(компонентов) комплекса (см. описание к патенту РФ 2195490,М.кл. 12 1/14, 2002 г). Приведенный способ по совокупности признаков и достигнутому положительному эффекту является наиболее близким техническим решением(прототипом). Штамм получают с помощью многоступенчатого классического мутагенеза и селекции из исходной культуры 6 а (ВКМ -2047). 2 Суспензию спор исходного штамма облучают ультрафиолетом. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, основу которых составляет среда Гетчинсона с добавлением 0,5 карбоксиметилцеллюлозы(КМЦ), культивируют при 28 С в течение 2 сут и проводят окрашивание Конго Красным. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше. Для получения посевного материала (инокулята) культуру грибаВКМ 3634 выращивают на сусло- или СМ- агаре при 29 С в течение 7 сут и далее при комнатной температуре на свету в течение 5 сут. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1 твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл,содержащих 100 мл жидкой среды следующего состава, в г/л свекловичный жом - 40,0 солодовые ростки - 14,0 (4)24 - 6,0 Н 2 Р 4 - 2,0 472 - 0,65,4. Колбы инкубируют на качалке при 30 С и 200 об/мин в течение 120 ч. Активность целлюлаз, бета-глюканаз, ксиланаз,пектиназ и маннаназ составляет 6,5 25,0 20,0 7,0 и 0,5 ед/мл соответственно. Недостатком является низкая целлюлозалитическая активность штамма 6,5 ед/мл. Технической задачей изобретения является получение в лабораторных условиях мутантного штамма мицелиального гриба 7. - продуцента фермента целлюлаз. Мутантный штамм получен в результате усиления свойств исходной культуры 7 при ступенчатой обработке нитрозометилмочевиной, ультрафиолетового и рентген облучения. Исходный штамм 7 выделен на плотной питательной среде Гетчинсона,методом последовательных разведений почвенной суспензии. Образцы почвы ризосферы сосны отобраны на территории Акмолинской области в 2012 г. Культивирован на среде Чапека при температуре 20-25 С в течение 7 сут. Идентифицирован с использованием определителя С.Р. Шварцман и др. Флора споровых растений Казахстана. Штамм гриба 7 на основании результатов анализа патогенности депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под 0551. Биологическая характеристика штамма 7. Морфолого-культуральные и физиологобиохимические особенности штамма При росте на агаризованной среде картофельный агар колонии прижатые, зональные темно-зеленые,быстрорастущие. Реверс белый с просвечивающими темными кругами. Конидиофоры, возникающие в основном из воздушных гиф, обычно содержат длинную ось, которая плодородна к кончику фиалиды возникают отдельно от основной оси на расстоянии приблизительно 45 мкм. Фиалиды удлиненно-бутылевидные с хорошо оформленной шейкой, размером (4,90-7,352,45-3,26) мкм. Конидии круглые, диаметром 2,85-3,26 мкм,одноклеточные, образуются на вершинах фиалид. Отношение к источникам углерода сахароза высокая, глюкоза - выше среднего, маннит высокая, мальтоза - средняя, лактоза - выше среднего, крахмал - высокая. Отношение к источникам азота усваивает 3,а 3, 43, (4)24, (4)224. Биологические свойства на лабораторных животных (патогенность) принадлежит к 3 классу патогенности. Область применения штамма в биотехнологии для получения ферментного препарата. Хранение в лиофильно высушенном состоянии при температуре не выше 0 С. Хранение на скошенной питательной агаризованной среде Чапека подкисленной до рН-56, при температуре 4 С, пересев 1 раз в 3-4 месяца. Криоконсервация при температуре -80 С. Информация о штамме включается в каталог коллекции до получения патента. Обладает ферментативными свойствами(целлюлозолитической активностью). Активности КМЦ-азная в культуральной жидкости на 120 ч культивирования оставила 5331 ед/мл. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм, депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов, под регистрационным номером