Штамм мицелиального гриба ASPERGILLUS AWAMORI 466 v-7-продуцент глюкоамилазы

(51) 12 9/34 (2010.01) 12 1/14 (2010.01) 12 1/665 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штамм мицелиального гриба 466 -7, депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК- 0211,продуцент глюкоамилазы. Предлагаемый штамм при культивировании на питательных средах, традиционно применяемых в производстве ферментных препаратов, обеспечивает более высокую глюкоамилазную активность культуралъной жидкости по сравнению с известными штаммами,что позволяет в значительной степени повысить выход глюкоамилазы с единицы субстрата.(57) Изобретение относится к биотехнологии,может быть использовано для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности. Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения глюкоамилазы с целью дальнейшего ее применения в спиртовой, хлебопекарной, крахмало-паточной и пивоваренной промышленности. Глюкоамилаза(-1,4-глюканглюканогидролаза, 3.2.1.3.) глюкозообразующая амилаза,экзофермент,атакует крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки,последовательно отщепляя глюкозные остатки и полностью превращая крахмал в глюкозу. Большинство глюкоамилаз микробного происхождения относятся к кислым ферментам,проявляющим максимальную активность при рН 3,5-5,5, и оптимумом температуры 55-60 С обладают широкой субстратной специфичностью. Отличительной особенностью глюкоамилаз является их способность гидролизовать как -1,4,так и -1,6 глюкозидные связи в полисахаридах и олигосахаридах (даже в низкомолекулярных, таких как паноза и изомальтоза). Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов,продуцирующие активную глюкоамилазу,имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии. Известны штаммы - продуценты глюкоамилаз и способы из культивирования, которые различаются главным образом видами применяемых штаммов грибов,субстратами,используемыми для ферментации и условиями проведения процесса. Стоимость получаемых ферментов определяется уровнем активности глюкоамилазы в культуральной жидкости, скоростью и продуктивностью синтеза ферментов, выходом ферментов с единицы использованного субстрата, стоимостью субстрата. Активными продуцентами глюкоамилазы являются микроорганизмы многих таксономических групп, таких как грибы рода- .,., ., ., .,., отдельные представителиидрожжи и дрожжеподобные грибы родов , ,и. В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода- . , . ,. , . , . , в том числе рекомбинантные. Использование рекомбинантных штаммов связано с необходимостью проведения постоянных исследований по поддержанию штаммов в стабильном и активном состоянии,созданием специальных условий культивирования,которые не всегда доступны при промышленном ведении процесса. В литературе описан продуцент глюкоамилазы.466, который при выращивании на 2 среде с кукурузной мукой, осахаренной солодовым молоком, с добавлением диаммонийфосфата на 184 часа роста синтезирует 183 ед/мл А.с. СССР 800185, С 12 13/10, 1981. Недостатком вышеуказанного штамма является низкая продуктивность по глюкоамилазе, сложность процессов (стадий) ведения и подготовки посевного материала, использование многокомпонентных дорогостоящих питательных сред для производственных ферментации, и как следствие этого - низкая рентабельность технологии производства глюкоамилазы. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение,получение нового высокопродуктивного штамма-продуцента глюкоамилазы, способного при культивировании на дешевых технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности глюкоамилазы и выход фермента. Технический результат заключается в получении штамма- продуцента, обеспечивающего значительно более высокую активность глюкоамилазы при культивировании на дешевых технологичных средах. Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм 466 -7 (- 0211) - продуцент глюкоамилазы. Штамм 466 -7 депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов под- 0211. Штамм получен в результате многолетней поддерживающей селекции на основе исходного штамм .466. Условия хранения штамм может храниться при температуре 3-5 С в течение 1 года на коротко скошенной агаризованной среде Чапека под вазелиновым маслом либо на скошенной агаризованной среде Чапека 3-5 С в течение 3 месяцев. Культурально-морфологические признаки штамма .466 -7 (- 0211). В процессе роста .466 -7 образует мицелий, состоящий из длинных ветвящихся нитейгиф. Нити мицелия бесцветные, ширина от 3 до 9 мкм, иногда встречаются гифы утолщенные (до 16 мкм). Конидиеносец размером 7-20 мкм, головка слегка удлиненной или округлой формы,встречаются слегка вытянутые. Оболочка конидий гладкая, размер конидий (3,23-8,412) мкм. Колонии на агаризованной среде Чапека с сахарозой колонии округлой формы, плотные,кожистые, слегка складчатые, с неровным краем. Колонии бесцветные на 1-е сутки роста, к 6 суткам постепенно желтеют и к 12 суткам становятся светло-коричневыми. Физиолого-биохимические свойства штамма Культура способна утилизировать без выделения газа крахмал, декстрины, сахарозу, мальтозу,лактозу использовать в качестве источника азота органические, нитратные, аммонийные его формы. Температурный оптимум роста 35-37 С, рН агаризованной среды Чапека 6,8-7,0. Аэроб. Данный вид мицелиального гриба не обладает вирулентными и патогенными свойствами. Полученный штамм отличается от исходного повышенной способностью к биосинтезу глюкоамилазы. Культивирование штамма .466 -7(- 0211) осуществляют в аэробных условиях при температуре 35-37 С в течение 7 суток, затем 7 суток при комнатной температуре, рН среды - 6,87,0. Для роста культуры и биосинтеза глюкоамилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, экструдат муки злаковых культур (кукурузы, пшеницы, ячменя,ржи), аммонийный азот, кукурузный экстракт. Пример 1. Посевной материал получают выращиванием штамма .466 -7 ( 0211) на твердой питательной среде Чапека,следующего состава сахароза 2, натрий азотнокислый 0,3, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1, магний сернокислый семи-водный 0,1, калий хлористый 0,05, агар 1,5 , вода дистиллированная до 100,рН среды - 6,8-7,0. Выращивание спорового посевного материала осуществляют в колбах,содержащих 30 г твердого субстрата, в стационарных условиях при температуре 35-37 С в течение 7 суток и при комнатной температуре в течение 7 суток. Полученный посевной материал в количестве 10 к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава,г/л кукурузная мука 100 г, вода - 300 мл, объем 1 л,рН среды 5,0-6,0. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35-37 С, на качалке с числом оборотов 180-220 об/мин, в течение 7 суток. Активность глюкоамилазы определяют через 7 суток культивирования. Определение глюкоамилазной активности проводят полярометрическим экспресс-методом. Метод основан на определении скорости гидролиза мальтозы глюкоамилазой. За единицу активности глюкоамилазы принимается такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля мальтозы при температуре 500,1 оС и рН 4,7 в течение 1 минуты. Результаты определения активности фермента глюкоамилазы поляриметрическим методом можно также выражать в единицах стандартного глюкооксидазного метода. В этом случае за единицу глюкоамилазной активности принимают такое количество фермента,которое, действуя на растворимый крахмал при 30 С и рН 4,7 в течение 1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы Препараты ферментные. ГОСТ 20264 4.89. - М. Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. - с.70. Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 168 ч роста составляет 250 ед/мл. Получение посевного материала исходного и мутантных штаммов .осуществляют по примеру 1. В таблице 1 представлены данные по биосинтезу глюкоамилазы исходным и заявляемым штаммами. . Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности глюкоамилазы в культуральной жидкости заявляемого штамма .466 -7 (по сравнению с исходным штаммом.466) более чем на 20-30 ед/мл. Таблица 1 Биосинтез глюкоамилазы различными штаммами .на ферментационной среде. 9 216 243 Таким образом, предлагаемый штаммФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 466 -7 (- 0211) при культивировании Штамм мицелиального грибана питательных средах, традиционно применяемых в производстве ферментных препаратов, обеспечивает 466 -7, депонированный в ДГП Республиканская более высокую глюкоамилазную активность коллекция микроорганизмов РГП Национальный культуральной жидкости по сравнению с известными центр биотехнологии МОН РК- 0211,штаммами, что позволяет в значительной степени продуцент глюкоамилазы. повысить выход глюкоамилазы с единицы субстрата. Верстка Косалиева Б. Корректор Мадеева П.А. 3