Штамм спорообразующих бактерий Bacillus brevis П2-96 для производства микробиотика, стимулирующего рост молодняка птицы

(51) 12 1/20 (2010.01) 12 1/08 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ микробиотика, применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Штамм спорообразующих бактерий Вас.П 2-96 обладает более высоким биосинтезом витаминов группы В и свободных аминокислот в частности витамина В 1 (тиамина) и аминокислотулизин и пригоден для производства микробиотика,применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Получение препарата - микробиотика из культуры Вас.П 2-96 осуществляется в условиях практики легко и доступно. Применение его в птицеводстве позволяет получить дополнительную продукцию в виде повышенной сохранности, прироста живой массы тела и повышения резистентности организма молодняка птицы к инфекциям.(76) Мыктыбаева Рая Жаксыгуловна Толысбаев Божбанбай Толысбаевич(56) Клевенская И.Г. Образование физиологически активных веществ микроорганизмами. Новосибирск Наука, Сибирскре отделение, 1975, с. 144(54) ШТАММ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙП 2-96 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МИКРОБИОТИКА,СТИМУЛИРУЮЩЕГО РОСТ МОЛОДНЯКА ПТИЦЫ(57) Изобретение относится к микробиологии, и в частности к выделению нового штамма спорообразующих бактерий для производства Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению нового штамма спорообразующих бактерий для производства микробиотика, применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Известны дрожжи, применяемые в птицеводстве в качестве микробиотика для стимуляции роста молодняка птицы (Калунянц К.А., Ездакова И.В. Пивняк И.Г. Применение продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. М,1980, с. 288). Недостатком является то, что в известных дрожжах содержится низкое содержание витамина В 1 а также аминокислот, в частности незаменимой аминокислоты лизина, и поэтому микробиотик на их основе обладает слабыми ростостимулирующими свойствами. Известны неспорообразующие бактерии родови , применяемые в птицеводстве в качестве микробиотика для стимуляции роста молодняка птицы (Клевенская И.Г. Образование физиологически активных веществ микроорганизмами. Новосибирск Наука,Сибирское отделение, 1975, с. 144). Недостатком является то, что данные бактерии имеют низкое содержание витамина В 1, а также аминокислот,в частности незаменимой аминокислоты лизина, и поэтому микробиотик на их основе обладает слабыми ростостимулирующими свойствами. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий,обладающего высоким биосинтезом витаминов группы В и свободных аминокислот, в частности витамина В 1 (тиамина) и незаменимой аминокислоты - лизина, и пригодного для производства микробиотика, стимулирующего рост молодняка птицы. Штамм спорообразующих бактерийП 2-96 выделен из почвы учебного хозяйства Аксай бывшего Алма-Атинского зооветеринарного института, путем посева проб почвы па жидкую среду Рубенчика с последующим выделением чистых культур мочевиноусваивающих бактерий с использованием твердых сред Рубенчика и Омелянското,и отбором штамма,продуцирующего витамины,аминокислоты,антибактериальные вещества. Авторами штамму присвоенП 2-96. Штамм спорообразующих бактерийП 2-96 депонирован в центральной коллекции микроорганизмов музея Института микробиологии и вирусологии Министерства образования и науки Республики Казахстан под номером ИМ и В В-27(от 4 ноября 1999 г.). Штамм имеет следующие свойства На МПА с 2,5-5 мочевинной - колонии смешанные круглые и неправильные (в виде снежинки), плоские, сероватобелые, с нитчатыми или неправильно изрезанными краями. Клетки прямые и слегка изогнутые палочки с закругленными концами размером 2-8 х 1 мкм. Встречаются нити. Споры овальные (1,5-2,5 х 12 1,5 мкм), расположены в центре, чаще на концах клеток. На синтетической твердой среде Рубенчика с 2,55 мочевиной - колонии неправильной формы,плоские, сероватобелые, с нитчатыми краями. Клетки прямые или слегка изогнутые палочки размером 2-81 мкм. Споры овальные (1,5-2,5 х 11,5 мкм), расположены на концах клеток. На жидкой синтетической среде Рубенчика с 2,55 мочевиной от скудного до умеренного помутнения, рН среды поднимается до 8.93. Клетки по форме палочки размером 2-81,5 мкм. На мясо-пептонной желатине а) характер роста по длине укола рост на поверхности и умеренный по линии укола б) рост по уколу нитевидный в) разжижение послойное.П 2-96 - аэробный мезофильный микроб (оптимальная температура в пределах 2830 С),обладает протеолитической и сахаролитической активностью. Ферментирует с образованием кислоты сахарозу, мальтозу, глюкозу,галактозу, маннит, сорбит, инозит, арабинозу,глицерин восстанавливает нитраты, гидролизует крахмал обладает каталазной, уреазной и гемолитической активностью не образует аммиак,сероводород и индол В качестве источников азота усваиваются мочевина, азотнокислый натрий, азотнокислый калий, хлористый аммоний, сернокислый аммоний,лимоннокислый аммоний (трехзамещенный), пептон и казеин (всего 8 источников) Источники углерода раффиноза, сахароза,глюкоза, маннит, галактоза, салицин, сорбит,арабиноза, глицерин, лимоннокислый натрий,яблочнокислый калий,пировинограднокислый натрий,молочнокислый калий(всего 13 источников) Гидролиз мочевины. В аэробных условиях на на жидкой среде Рубенчика при росте покое рН-6,65-8,2 гидролиз мочевины составляет 17,0-9,5 г/л, а с буферами 8,511,8 г/л Данные по метаболизму. Образование витаминов и аминокислот наблюдается как при росте культуры в покое, так и при аэрации на синтетической среде Рубенчика. Так при росте в условиях покоя образует витамины тиамин(В 3),никотиновую кислоту (РР В 5), пиридоксин (В 6),биотип (В 7), кобаламин (В 12) и девять аминокислот фенилаланин, гистидин, триптофан, метионин,лизин, лейцин, аргинин, тирозин, пне тин. Количественное содержание их приведено в таблицах 3 и 4. Антагонизм На МПА (при исследовании методом агаровых блоков) подавляет рост золотистого стафилококка(. ) на синтетической среде Рубенчика(штамм 220) и .(штамм 971).П 2-96 сохраняет свой морфологофизиологические свойства на полужидком МПА с мочевиной и без нее и в столбике ПА под вазелиновым маслом высотой до 1 см, а также в лиофилизированном состоянии в ампулах, в условиях холодильника, что это доказано экспериментально, т.е. в примененных нами методах выживаемость уробактерий доходит до 2025 лет. При выращивании штамма на среде оптимизированной но Бирюков (1968), Бирюкову, Кантаре (1985) с исходной средой Рубенчика резко увеличивается выход биомассы от 250 млн. до 15 млрд м.к. в 1 мл среды. В таблице 1 показан состав оптимизированной среды дляП 296. Таблица 1 Состав оптимизированной среды дляП 2-96 (по Бирюкову (1968), Бирюкову, Кантаре Содержание компонентов на 100 мл. среды, г Рубенчика(исходная) 1. Мочевина 2. Лимоннокислый натрий З.КН 3 РО 4 4.5. 42 6.3 4 7.Дистиллированная вода (мл) 8.рН среды 9.Количество клеток в 1 мл среды 11. Рост культуры через суток Как видно из таблицы 1, что выход биомассы уП 2-96 доходит до 15 млрд м.т, и более, т.е. в 60 раз больше в оптимизированной среде по сравнению с исходной средой и сокращается срок культивирования с 6 до 4 суток. Культура выращивается в колбах - качалках(240-250 об/мин) или ферментерах с объемом 0,5 м 3. Посевной материал содержащий не менее 60 млрд. микробных тел в 1 мл вводят в количестве 2,5 к общему объему среды. Ферментация проводится в ферментерах при аэрации 40 м 3 воздуха на 1 м культуральной жидкости в час в течение 4-х суток. При этом она дает равномерное обильное помутнение при температуре, 28-30 С и 7,2-7,4. Были проведены сравнительные исследования с известными видами олигонитрофильных и мочевиноусваивающих спорообразующих бактерий п. трансформирующих мочевину в микробный белок, продуцирующих витамины группы В,свободные аминокислоты,антибактериальные вещества и используемых в качестве стимуляторов роста при выращивании цыплят птицы. Полученные материалы представлены в таблицах 2 и 3. Из таблицы 2 видно, что олигонитрофильные микроорганизмы образуют отдельные витамины группы В в незначительном количестве. По сравнению с ними мочевиноусваивающие бактерии, наоборот, их образуют в значительном количестве. Среди них по биосинтезу витамина В 1 (тиамин) на 1-ом месте стоит Вас.(шт. П 2-96). Из таблицы 3 видно,что штамм бактерий Вас.(шт. П 2-96) более эффективен по качественному набору витаминов и свободных аминокислот (таблицы 4) и по их количественному содержанию, особенно витамина В 1 (тиамина) и аминокислоту-лизина. Далее штамм бактерийП 2-96 исследовали на свободные аминокислоты. При этом для сравнения нами был взят,штамм 27(,активно трансформирующий мочевину в микробный белок и образующий физиологически активные вещества (таблица 4). Из таблицы 4 наглядно видно, чтоП 2-96 образует 9 свободных аминокислот, семь из них незаменимые фенилаланин,гистидин,триптофан, метионин, лизин, лейцин, аргинин остальные заменимые аминокислоты тирозин,цистин. Из изложенного материала (таблица 4) Вас.П 2-96 выгодно отличается от культурыпо составу экстрацеллюлярных аминокислот. При выращивании уробактерий на новой оптимизированной безбелковой синтетической среде также увеличивается выход физиологически активных веществ (таблица 5). Проведенное исследование показало (таблица 5), что в готовом препарате-микробиотике уП 2-96 содержание главного витамина тиамина (В 1) достигает до 380 мг/кг, фенилаланина до 730 мг/кг,гистидина до 530 мг/кг, триптофана да 810 мг/кг,метионина до 780 мг/кг, лизина до 3,2 г/кг, лейцина 3 до 1,5 г/кг аргинина до 1,2 г/кг, т.е. выход их заметно увеличивается. Пример приготовлении препарата 1. Перед приготовлением препарата микробиотика культуральную жидкостьП 2-96 встряхивают для равномерного распределения биомассы (которая выпадает в осадок) и смешивают с пшеничными отрубями из расчета 11 (1 л культуральной жидкости на 1 кг отрубей) 2. Смесь культуры с отрубями необходимо сушить на лотках в сушильном шкафу при температуре 60 С до массовой доли волы 10-12. При более массовой температуре биологически активные вещества инактивируются и качество препарата снижается 3. Высушенные препараты измельчают на мельнице ДКУ-1,2 4. Готовые препараты расфасовывают в бумажные мешки, на которые наклеивают этикетки с указанием наименование препарата, количества,дата изготовления и срока годности 5. В высушенном состоянии препараты сохраняют свою активность не менее 1 года при обычных складских условиях хранения кормов. Норма дачи готового препарата устанавливается по витамину В 1 (тиамину) 2 мг на 1 кг комбикорма. Пример эффективности препарата Известно, что для здоровья птиц, их нормального роста и развития, высокой яйценоскости и хорошей выводимости необходимо содержание в их корме комплекса всех витаминов. Отсутствие в корме любого из витаминов обесценивает другие витамины и глубоко нарушает физиологические процессы в организме. Микробиотики из уробактерий апробировали на эффективность на 6000 цыплятах яйценосной народы Кросс-Родонит птицефабрики ТОО Алтын-ай Карасайского района Алматинской области с суточного до 30 дневного возраста Применение микробиотика подопытным цыплятам из культуры Вас.П 2-96 способствовало повышению привеса каждого из них на 19 и сохранности до 98,2 по сравнению с контрольной группы таблицы 6. Кроме того,положительные изменения наблюдаются в гематологических показателях повышается содержание гемоглобина, увеличивается количество эритроцитов и лейкоцитов в крови. Одним из показателей резистентности цыплят в раннем возрасте является их выживаемость(Мишнаевский . 1971). Обычно в первые 10-12 дней жизни наблюдается значительный естественный отход. Однако в наших опытах, этого не наблюдалось благодаря использованию препаратамикробиотика уробактерий из их нового штамма. Надо полагать, что отсутствие естественного отхода и увеличение сохранности цыплят в первые дни жизни достигнут в результате повышения резистентности организма. Цыплята опытной группы получившие препараты микробиотик из уробактерий, намного больше поедали корма, были подвижнее, имели гладкое оперение, более желтую пигментацию лап и клюва, а петушки хорошо развитые гребни. Таким образом, на основании проведенных опытов на цыплятах доказано, что микробиотик из уробактерийП 2-96 оказывает положительное влияние на организм цыплят. При том существенно возрастают показатели сохранности, прироста живой массы (привеса) а также содержание гемоглобина,количество эритроцитов и лейкоцитов в крови. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм спорообразующих бактерийП 2-96, депонирован в центральной коллекции микроорганизмов музея Института микробиологии и вирусологии Министерства образования и науки Республики Казахстан под номером ИМиВ В-27, для производства микробиотика, стимулирующего рост молодняка птицы.