Применение штамма бактерий Pseudomonas ureae 27 п для приготовления микробиотика

(51) 61 2/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ витаминов группы В и свободных аминокислот в частности витамина В 1 (тиамина), В 3 (пантотеновой кислоты),В 5(пиридоксина), В 7 (биотина), В 12 (кабаламина) и аминокислоту - лизин и пригоден для производства микробиотика, применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Получение препарата - микробиотика из культуры-27(п) (ИМиВ В-35) осуществляется в условиях практики легко и доступно. Применение его в птицеводстве позволяет получить дополнительную продукцию в виде повышенной сохранности, прироста живой массы тела и повышения резистентности организма молодняка птицы к инфекциям.(57) Изобретение относится к биотехнологии микроорганизмов, в частности к выделению нового штамма бактерий для приготовления микробиотика,применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Штамм бактерий-27(п) (ИМиВ В-35) обладает более высоким биосинтезом 24229 Изобретение относится к биотехнологии микрорганизмов, в частности к выделению нового штамма бактерий для приготовления микробиотика,применяемого для стимуляции роста молодняка птицы. Известен штамм бактерийКРС-53 (ИМ и В-34), используемый для приготовления премиксов, трансформирующий мочевину в белковый азот, в процессе роста продуцирующий физиологически активные вещества(витамины,аминокислоты),способствующий при добавлении в корм получению дополнительного привеса у цыплят мясных пород птицы до 17,8 и повышению сохранности до 99,6. (Предварительный патент РК 11525,МПК 712,12 138, опубл. 15.02.2002 г., бюл. пат. вед. РК 5). Недостатком являетя то, что этот штамм продуцирует незначительное количество витамина В 1 В 3, В 5, В 6, В 7, В 12, а также аминокислот, в частности незаменимой аминокислоты лизина, и поэтому микробиотик на его основе обладает слабыми росгостимулирующими свойствами. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего способностью трансформировать мочевину в белковый азот, в процессе роста продуцировать физиологически активные вещества (витамины, аминокислоты),стимулирующего рост молодняка цыплят мясных пород. Штамм выделен из содержимого рубца крупного рогатого скота с последующей селекцией на твердых средах Омелянского и Рубенчика. Его хранят на полужидком МПА с мочевиной или без нее под слоем вазелинового масла или в лиофильно высушенном состоянии. Штамм(27(п депонирован в коллекции музейных культур микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан под номером ИМиВ В-35 и имеет следующую характеристику. Культурально-морфологические признаки На МПА колонии с лучистым венцом, сероватобелые, блестящие, сочные, изогнутые с ветвистыми краями 2-5 мм, рост обильный. На МПА с 5-ной мочевиной колонии как на МПА. Клетки по форме коккобактерии (0,5-0,7 мкм) и мелкие овоидные палочки (размером 1-20,5-0,7 мкм). На синтетической твердой среде Рубенчика с 5-ной мочевиной колонии круглые, выпуклые с фестончатыми краями размером 2-3 мм и более. Клетки по форме коккобактерии (0,5-0,7 мкм) и мелкие овоидные палочки (размером 1-20,5-0,7 мкм). На МПБобильное помутнение с пленкой и рыхлым осадком. На МПБс 5-ной мочевиной колонии как на МПБ. На полужидком МПА и аналогичной среде с 5 ной мочевиной обильное помутнение с образованием пленки и осадка. 2 На минеральной (синтетической) жидкой среде Рубенчика с 5-ной мочевиной отмечается обильное помутнение с беловато- рыхлым осадком на дне пробирки. Клетки по форме коккобактерии(0,6-0,8 мкм) и мелкие овоиды (размером 1-20,8 мкм). Клетки подвижны, грамотрицательны и хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красками. Физиолого-биохимические признаки Отношение к источникам углерода ферментирует с образованием кислоты (на среде Андредэ) в течение 1-2 суток раффинозу, лактозу,сахарозу, мальтозу, глюкозу, галактозу, маннит,сорбит, салицин, ксилозу, глицерин усваивает раффинозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, глюкозу,галактозу, маннит, дульцит, салицин, сорбит,арабинозу, инозит, глицерин, лимоннокислый натрий, яблочнокислый калий, виннокислый натрий,щавелевокислый натрий, пировинограднокислый натрий, уксуснокислый натрий, фумаровокислый натрий, молочнокислый калий (21 источник). Отношение к источникам азота усваивает мочевину, азотнокислый натрий, азотнокислый калий, хлористый аммоний, сернокислый аммоний,азотнокислый аммоний, фосфорнокислый аммоний,лимоннокислый аммоний(трехзамещенный),щавелевокислый аммоний, углекислый аммоний,уксуснокислый аммоний, виннокислый аммоний,пептон, казеин (всего 15 источников). Редукция синьки, каталазная и уреазная активность хорошо выражены на кровяном агаре гемолиз эритроцитов барана отмечается через две недели после посева культуры штамма штамм образует аммиак и сероводород, хотя не обладает протеолитической и амилолитической активностью не образует индол. На синтетической жидкой среде Рубенчика рост штамма стимулирует такие аминокислоты, как лейцин, -метионин, -аргинин солянокислый,-валин, -треонин, -гистидин солянокислый,-лизин солянокислый,-фенилаланин,глицин, -серин, -тирозин, -пролин, -аланин, -глутиамин, -аспарагин, -глутиами новая кислота, -изолейцин, особенно цистин и цистеин, которые взаимозаменимы, за исключением триптофана и аспарагиновой кислоты. Урожай культуры штамма на средах с вышеуказанными отдельными аминокислотами доходит от 900 млн. до 1,5 млрд. м.т. в 1 мл среды. Сильными стимулирующими действиями также обладают смеси, составленные из 20, 18, 17, 16, 15,14, 13, 12, 10 и 9 аминокислот в составе 18 аминокислот отсутствуют лизин, глицин 17 аминокислот - лизин, глицин, триптофан 16 аминокислот - лизин, глицин, триптофан, аланин 15 аминокислот - лизин, глицин, триптофан, аланин,гистидин 14 аминокислот - лизин, глицин,триптофан, аланин, гистидин, тирозин 13 аминокислот -лизин, глицин, триптофан, аланин,гистидин, тирозин, фенилаланин 12 аминокислот лизин, глицин, триптофан, аланин, гистидин,тирозин, фенилаланин, аспарагиновая кислота 10 аминокислот - лизин, глицин, триптофан, аланин, 24229 гистидин, тирозин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, лейцин, пролин 9 аминокислот - лизин,глицин, триптофан, аланин, гистидин, тирозин,фенилаланин, аспарагиновая кислота, лейцин,пролин, изолейцин - урожай клеток на средах с перечисленными смесями аминокислот доходит от 3-х до 9 млрд. м.т. в 1 мл среды. Гидролиз мочевины. На жидкой синтетической среде Рубенчика без буферов в аэробных условиях при росте в покое рН - 6,7-8,2 гидролизует мочевину от 14,5 до 19,7 г/л на указанной среде с фосфатными буферами (242472) от 10 до 14,5 г/л. Штамм бактерий . (27(п синтезирует на безбелковой среде несколько витаминов из группы В как при росте культуры в покое, так и при аэрации. В среде культивирования аккумулируются такие витамины как В 1 (0,5705 г/л), В 3 (0,2171 г/л),В 5 (0,0446 г/л), В 6 (1,0041 г/л), В 7 (0,0099 г/л), В 8(4,3907 г/л), В 12 (80 мкг/л). Штамм кроме витаминов,образует антибактериальные вещества в отношении бактерий кишечной группы (., ., .,., ., . , .,.) и шаровидных бактерий( ,),являющихся возбудителями инфекционных болезней животных. Наряду с вышеуказанными антибактериальными веществами, штамм также синтезирует бактериоцины к . , .,., ., . на МПА и П. с мочевиной, последние четыре вида бактерий (за исключением . ) по многим свойствам близки. (27(п. Штамм устойчив к пенициллину и нитрофурановому препарату фуразолидону слабочувствителен к биомицину, террамицину,тетрациклину чувствителен к стрептомицину,левомицетину,полимиксину,эритромицину высокочувствителен к неомицину и мономицину. Хороший рост штамма отмечается в пределах температуры 28-37 С. Диапазон рН для роста - 6,7-8,2. Дыхание штамма аэробное и факультативноаэробное. Штамм непатогенен и нетоксичен. Штамм, взятый в качестве прототипа, по выходу сухой биомассы, белка (общего и истинного),внеклеточных витаминов (табл.1), коэффициенту отношения суммы незаменимых аминокислот к сумме заменимых (табл.2) и содержанию белкового азота в синтетической среде существенно отстает от предлагаемого штамма(27(п,используемого для приготовления микробиотика. Выход биомассы, белка (общего и истинного),внеклеточных витаминов группы В показаны в табл.1. Из представленных материалов в табл.1 видно, что штамм . (27(п выгодно отличается от прототипа по содержанию В 1(тиамина), В 3 (пантотеновой кислоты), особенно В 6(пиридоксина), В 7(биотина), В 8 (инозита) и В 12(кобаламина). Штамм . крс-53 отстает также по выходу биомассы и белка. Количественное содержание отдельных аминокислот (в ) по отношению сухой биомассе штаммов представлено в табл.2. Из табл.2, видно, что у штамма .(27(п коэффициент отношения суммы незаменимых аминокислот к сумме заменимых составляет 1,086 (у прототипа -1,080). В состав липидов входят фосфолипиды (19,5), моноглицериды (27,54),диглицериды (7,0), триглицериды (19,56) и углероды (26,4) по отношению к общему количеству липидов. Анализ проводится методом ТСХ в системе перволинейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85151). Жирно- кислотный состав триглицеридной фракции липидов штамма. (27(п представлен в табл.3. Анализ материалов табл.3 и 4 и показывают, что по жирнокислотный составу триглицеридной фракции липидов, содержание нуклеиновых кислот,липидов, золы и фосфора между предлагаемым штаммом и прототипом нет существенной разницы. Проводилась оптимизация безбелковой синтетической среды Рубенчика с целью повышения выхода биомассы, ФАВ и сокращения срока культивирования для . (27(п используя математический метод планирования экспериментов по В.В. Бирюкову (1968) и В.В. Бирюкову, В.И. Кантаре (1985). Выращивание культур проводится в ферменторе с объемом 0,5 м 3 при температуре 28 С и аэрации 40 м 3/ч. в течение 2-3 суток.. (27(п до оптимизации образует витамины и свободные аминокислоты как при росте культуры в покое, так и при аэрации на синтетической среде Рубенчика. Так по мере роста культуры . (27(п в среде накапливаются 7 витаминов тиамин (В 1), пантотеновоя кислота (В 3),никотиновая кислота (В 5 РР), пиридоксин (В 6),биотин (В 7), инозит (В 8) и кобаламин (В 12). среди них доминирующим является пиридоксин (В 6) в 1 л культуральной жидкости его содержание доходит до 1764 мг. Бактерия синтезирует также такие экстрацеллюлярные аминокислоты как фенилаланин, триптофан, лизин, пролин, серии,глицин(всего 6 аминокислот) ведущей аминокислотой является лизин(1989 мг синтезируется в 1 л культуральной жидкости). Свободные аминокислоты образуемые псендомонадами, и их содержания приведены (в г/л) в табл.5. Из табл.5 видно, что . выгодно отличается от прототипа по содержанию отдельных аминокислот и лизина образует почти до 2-х граммов. В табл.6 показан состав оптимизированной безбелковой синтетической среды. Из приведенной табл.6 видно, что после оптимизации количество микробных клеток в 1 мл доходит до 20 млрд. (т.е. количество клеток увеличивается до 20 раз) и срок культивирования сокращается с 6 до 3 суток. Количественное содержание физиологически активных веществ (главного витамина и свободных аминокислот) в микробиотике из культуры . 24229 Проведенное исследование показало, что в готовом микробиотике у . (27(п содержание витамина В 6 (пиридоксина) достигает до 2 г/кг,фенилаланина до 0,680 мг/кг, триптофана до 0,680 мг/кг, лизина до 2 г/кг. Все это явно доказывает, что оптимизация также положительно влияет на выход физиологически активных веществ. Приготовление микробиотика состоит из следующих этапов Получение посевного материала Выращивание культуры в оптимизированной синтетической среде Определение витаминов группы В и свободных аминокислот в культуралыюй жидкости .. в условиях кафедры микробиологии включает следующие последовательности Перед приготовлением микробиотика культуральную жидкость, содержащую в больших бутылях (с объемом 10 л) встряхивают для равномерного распределения биомассы (которая выпадает в осадок) и смешивают с пшеничными отрубями из расчета 11 (1 л культуральной жидкости на 1 кг отрубей) Смесь культуры с отрубями необходимо сушить на лотках в сушильном шкафу при температуре 60 С до массовой доли до 10-12. При более высокой температуре биологически активные вещества инактивируются и качество препарата снижается Высушенную массу измельчают на мельнице ДКУ-1, 2 Готовый микробиотик расфасовывают в бумажные мешки на которые наклеивают этикетки с указанием наименования препарата, количества,даты изготовления и сроки годности В высушенном состоянии микробиотик сохраняет свою активность не менее года при обычных складских условиях хранения биопрепаратов. Пример эффективности препарата Органолептические,физико-химические и биологические показатели микробиотика из культуры . (27(п приведены в табл.8. Микробиотик из культуры уробактерий .(27(п апробирован на эффективность на 6000 цыплятах яйценосной породы Кросс-Роданит птицефабрики ТОО Алтын-Ай Карасайского района Алматинской области с суточного до 30 дневного возраста. Полученные данные этого опыта показаны в табл.9. Применение микробиотика из культуры уробактерий(27(п способствовало повышению сохранности до 98,6 и дополнительного привеса до 120. Кроме того,повышается содержание гемоглобина,увеличивается количество эритроцитов и лейкоцитов в крови. Таким образом, на основании проведенных опытов на цыплятах установлено, что микробиотик из культуры . является биологическим стимулятором роста молодняка птицы и его нужно использовать в качестве источника, богатого физиологически активными веществами. Следует еще подчеркнуть, что микробиотик из штамма. может найти свое применение в отношении цыплят яйценосных и мясных пород птицы. Таблица 1 Выход сухой биомассы, белка (общего и истинного), внеклеточных витаминов группы В у штамма .(27(П и прототипа . (шт. крс-53) Вещество сухая биомасса, г/л Общий белок,на сухую биомассу Истинный белок,к общему белку Тиамин (В), г/л Пантотеновая кислота (В 3), г/л никотиновая кислота , г/л Пиридоксин (Вб), г/л Биотин (В 7), г/л Инозитг/л Кобаламин (Вц), мкг/л 24229 Таблица 2 Аминокислотный состав белка штаммов . (27(, .(крс-53) и количественное содержание отдельных аминокислот (в ) к сухой биомассе Изолейцин Лейцин Фенилаланин Метионин Треонин Триптофан Валин Лизин Аргинин Гистидин Тирозин Цистин Алании Аспарагиновая кислота Глутаминовая кислота Глицин Пролин Серин Количество,к сухой биомассе штаммов 27(п) 4,60 8,21 4,80 3,50 4,65 4,60 6,65 5,88 5,78 3,40 3,83 0,28 8,40 8,56 9,10 6,07 4,12 7,57 Жирно-кислотный состав триптицеридной фракции липидов штамма . (27(П и протипного штамма . (к-53) Лауриеновая Миристиновая Пальмитиновая Стеариновая Арахиновая Пальмитолеиновая Олеиновая Линолевая Линоленовая Арахиновая Количество,от сухой биомассы 27(п) крс-53 5 Истинный белок Нуклеиновая кислота Липиды Зола Фосфор Свободные аминокислоты образуемые псевдомонадами, и их содержание Таблица 6 Состав оптимизированной среды для . (27(П Содержание компонентов на 100 мл среды, г Рубенчика(исходная) Оптимизированная Мочевина 5,0 0,726 лимоннокислый натрий 1,0 1,150 КН 2 РО 4 0,1 0,037 0,1 0,1 О 47 Н 2 О 0,05 0,1 3 следы 4 5 мг/л Дист, вода (мл) 100 100 рН среды 7,2 7,2 Количество микробных клеток 1 млрд. 20 млрд. в 1 мл среды рост культуры (через 3 суток) 6 3 Содержание витамина Вб (пиридоксина) и свободных аминокислот, образующихся культурой . Органолептические, физико-химические и биологические показатели микробиотика из культуры . Наименование показателя Внешний вид и цвет Характеристика и нормы Однородный порошок кремового цвета Продолжение таблицы 8 Специфический для данного микробиотика Массовая доля влаги,10 Массовая доля остатка после просеивания на сите с 5 сеткой из металлической проволки 067, , не более Массовая доля витамина В 6, г/кг 2 0,2 Безвредность в тест-дозе, мг -на белую мышь -на 6,0 110,0 цыпленка Запах Таблица 9 Показатели сохранности и привеса цыплят получавших и не получавших микробиотик из культуры уробактерий . (27(п Группы контрольная,получала 3000 2850 основной рацион (ОР) хозяйства без микробиотика- подопытная, получала 3000 2958 микробиотик из культуры . Применение штамма бактерий 27 п для приготовления микробиотика.