Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности “3L”

(51) 12 15/00 (2006.01) 12 15/67 (2006.01) 12 15/09 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ относится к области биотехнологии растений,генетической инженерии растений и молекулярной биологии растений. Достигаемый технический результат - повышение энхансерного эффекта, опосредуемого регуляторной последовательностью,расположенной в 5 нетранслируемой области и начале кодирующей области рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Предлагается для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена помещать энхансерную последовательность 3-3). Данная нуклеотидная последовательность, находясь перед кодирующей областью рекомбинантной мРНК, способна повышать уровень ее экспрессии в 7,8 раз.(72) Искаков Булат Кудайбергенович Полимбетова Найля Сейтжановна Жигайлов Андрей Викторович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭНХАНСЕРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 3(57) Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности 3 Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности 3 относится к области биотехнологии растений,генетической инженерии растений и молекулярной биологии растений. Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной энхансерной последовательности- . 239-247). Данный способ заключается в помещении в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной нуклеотидной последовательности(5-3), комплементарной участку 11131122 центрального домена пшеницы (.). Недостатком данного метода является низкая эффективность функционирования энхансерной последовательности, а также - то обстоятельство, что энхансерная последовательность помещается целиком в 5-нетранслируемую область рекомбинантных мРНК. Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной энхансерной последовательности(Инновационный патент 24560 от 03.08.2011). Данный способ заключается в помещении в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной нуклеотидной последовательности(5 САСАА-3) с целью повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Недостатком данного метода является недостаточно высокая эффективность функционирования энхансерной последовательности, а также - то обстоятельство, что энхансерная последовательность помещается целиком в 5-нетранслируемую область рекомбинантных мРНК. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности для повышения энхансерного эффекта, опосредуемого регуляторной последовательностью, расположенной в 5-нетранслируемой области и начале кодирующей области рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Задача достигается тем, что для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена помещают энхансерную последовательность, но, в отличие от известного способа, в качестве энхансерной последовательности используют нуклеотидную последовательность 3 (52(подчеркнут двумя сплошными линиями) и сегмент,комплементарный участку 1641-1652 шарнирного района 18 рРНК пшеницы (подчеркнут пунктирной линией). В силу своей комплементарности к трем экспонированным в составе 40 рибосомных сучастиц участкам 18 растений,нуклеотидная последовательность 3 должна напрямую связываться с 18 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц, привлекая к мРНК дополнительное количество рибосомных субчастиц и повышая, таким образом, уровень их трансляции. Энхансерная последовательность 3-кодон (нуклеотиды, формирующие данный триплет, выделены полужирным шрифтом). Поэтому при клонировании нуклеотидной последовательности 3 перед геном целевого белка, ее 3-проксимальная часть будет находиться в кодирующей области рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Этой особенностью энхансерная последовательность 3 отличается от известных искусственных трансляционных энхансерных последовательностейи , которые целиком помещаются в 5 нетранслируемые области рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Энхансерный эффект, опосредуемый последовательностью 3,выше, чем у известных искусственных энхансерных последовательностейи . ДНК-фрагмент, содержащий в своем составе последовательность 3, может быть синтезировани встроен по сайтам рестрикции перед кодирующей областью различных генов в рекомбинантные ДНК - конструкции, позволяющие осуществлять экспрессию генов целевых белковидля повышения уровня экспрессии этих генов. Пример 1. В качестве примера приводится способ клонирования последовательности 3 перед репортерным геном,кодирующим глюкуронидазуиз. Для встраивания последовательности 3 в ДНКконструкцию - (созданную на основе вектораи содержащую промотор бактериофага Т 7, линкерный участок, включающий сайты рестрикции ,и , репортериый ген/ и 3-НТП геномной РНК вируса табачной мозаики) по сайтам рестрикциии ,синтезируют два олигодезоксирибонуклеотида 1) 5 АТ СССС 3 и 2) 5-СА Проводят отжиг этих двух олигонуклеотидов при температуре 96 С в течение 2 минут с последующим постепенным охлаждением до комнатной температуры. При этом образуется следующий ДНК-фрагмент 53 35 5-концы полученного ДНК-фрагмента фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 50 мкл,содержит 100 мМ трис-НС ( 8,0), 5 мМ ДТТ, 10 мМ 2, 0,05 мМ АТР, 20 единиц полинуклеотидкиназы фага Т 4 и 0,5 мкмоль описанного выше ДНК-фрагмента. Реакцию проводят при температуре 37 С в течение 30 минут. После окончания инкубации реакционную смесь депротеинизируют смесыо фенол хлороформ в соотношении 11(о/о). Для осаждения фосфорилированного ДНК-фрагмента к водной фазе прибавляют 0,8 объемов изопропанола, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугируют на 20000 при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадок промывают 70 этанолом, сушат на воздухе и растворяют в 20 мкл стерильной бидистиллированной воды. Лигирование фосфорилированного ДНКфрагмента,содержащего в своем составе последовательность 3 с векторной ДНК -,обработанной рестриктазамии ,проводят с помощью ДНК - лигазы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит 66 мМ трис- НС 1 ( 7,6), 6,6 мМ 2, 10 мМ ДТТ, 0,066 мМ АТР, 100 нг векторной ДНК, 50 нг вставки и 1 ед. Т 4 ДНК-лигазы. Инкубацию проводят при температуре 12 С в течение 12 часов. Лигазную смесь исиользуют для трансформации компетентных клеток бактерий Е.штамма -1 или 5, которые затем высаживают на твердую питательную среду Лурия - Бертани ,содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Проводят скрининг колоний. Выделяют из бактерий ДНК-конструкцию 7-3 с использованием коммерческого набора для выделения плазмидной ДНКфирмыпо методике производителя. Проводят рестрикцию полученной ДНКконструкцией с использованием рестриктазы . Проводят реакцию транскрипциис использованием ДНК - зависимой РНК-полимеразы фага Т 7. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержит 250 мМ - ( 7,5), 30 мМ 2, 40 мМ ДТТ, 2 мМ спермина, по 7 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 50 ед. ингибитора рибонуклеаз, 30 ед. РНК-полимеразы фага Т 7 и 2 мкг линеаризованной ДНК конструкции 7-3,обработанной рестриктазой . Инкубацию проводят при температуре 37 С в течение 3 часов. Полученный транскрипт 3- используют в качестве мРНК для трансляциив бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 20 мМ трис-Ас ( 7,6), 90 мМ КОАс, 2,5 мМ 2,1,6 мМ ДТТ, 1 мМ АТР, 0,1 мМ , 10 мМ креатинфосфата, 0,12 мг/мл креатинфосфаткиназы,0,1 мМ спермидина, по 0,1 мМ каждой из аминокислот, 1 мкг мРНК и 11 мкл бесклеточного экстракта из зародышей пшеницы. Инкубацию проводят при температуре 26 С в течение 1 часа,после чего определяют -активность смеси. Таблица 1 Эффективность трансляции различных мРНК-конструкций в бесклеточной системе из зародышей пшеницы РНК-конструкция Среднее значение -активности, ед. флуоресценции 1005 40515 65657 378062 Примечания 1. РНК-конструкция - перед репортерным геномА содержит линкерную последовательность(53), не обладающую энхансерными свойствами РНК-копструкция перед репортерным геномсодержит энхансерную последовательность , РНК-конструкция- перед репортерным геномсодержит энхансерную последовательность , РНКконструкция 3- перед репортерным геномсодержит энхансерную последовательность 3 2. значения -активности представлены в виде Хр, где Хр - значение среднего арифметического, где- ошибка среднего арифметического. Таким образом, уровень экспрессии мРНКконструкции, содержащей перед репортерным геном энхансерную последовательность 3,в бесклеточной системе из зародышей пшеницы увеличивается в 7,6 раз по сравнению с контрольной мРНК-конструкцией -, не содержащей перед репортерным геном энхансерных последовательностей (см. Таблицу 1). Энхансерный эффект последовательности 3 почти в 2 раза выше, чем у последовательности , и почти в(см. уровень экспрессии мРНК-конструкции 3 по сравнению с уровнем экспрессии мРНКконструкций и соответственно). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах,3 включающий помещение в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена энхансерной последовательности,отличающийся тем, что в качестве энхансерной последовательности используют нуклеотидную последовательность 3