Система праймеров для выявления ДНК чумного микроба методом полимеразной цепной реакции в режиме мультиплекс

(51) 12 15/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СИСТЕМА ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ЧУМНОГО МИКРОБА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ МУЛЬТИПЛЕКС(57) Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Описана тест-система праймеров для использования в ПЦР в режиме мультиплекс для выявления нуклеотидных последовательностей ДНК чумного микроба,кодирующих родовые и видовые признаки,локализованных на трех основных плазмидах микроба , ,, 1, ,соответственно. Тест-система обладает необходимой специфичностью и высоким уровнем чувствительности при низких затратах на проведение ПЦР-анализа. Изобретение может быть использовано в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями.(72) АБДИРАСИЛОВА Айгуль АкзамовнаКУРМАНОВ Бержан КоразовичЖУНУСОВА Айгуль СагиндыковнаКАСЕНОВА Алтынай КамеловнаЗАКАРЯН Саркис Багратович АБДЕЛИЕВ Зият ЖумадиловичМОТИН ВладимирАТШАБАР Бакыт Бакиевич(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева Комитета государственного санитарно-эпидемиологичекого надзора Министерства здравоохранения Республики Казахстан(74) Тагбергенова Модангуль Маруповна Тагбергенова Алма Таишевна Изобретение относится к биотехнологии,медицине и ветеринарии, в частности к средствам диагностики бактерий родаи может быть использовано в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за особо опасными инфекциями. В настоящее время существует проблема ускоренной идентификации и быстрой дифференциации возбудителей бактериальных инфекций, представляющих наибольшую угрозу для мирного населения, в частности отнесенных к категории А (согласно классификации центра по контролю за инфекционными заболеваниями США),включающей патогены, вызывающие высокий уровень заболеваемости и смертности в силу способности легко передаваться от человека к человеку, провоцирующие панику среди населения,а именно возбудителей чумы. Во время вспышки чумы при проведении противоэпизоотических мероприятий необходимо быстро и точно определить закономерности эпизоотического процесса, провести исследования очага инфекции и зараженной территории, которые позволили бы в кратчайшие сроки идентифицировать возбудитель. Родвключает 11 видов бактерий, среди которых известными в медицине на данный момент являются три вида (. - возбудитель чумы,. - возбудитель псевдотуберкулеза и . - возбудитель кишечного иерсиниоза) ( .,. .,.. 8.2003. .672-83). Первый микроорганизм, ., вызывает острое инфекционное заболевание человека бубонной и легочной формами чумы (, Т. 1998., .281-293., .,, ,). Два других вызывают острые бактериальные энтериты,основными клиническими формами которых являются энтероколит, острый мезентериальный лимфаденит и терминальный илеит (, 1989., ). Одним из современных и наиболее перспективных лабораторных методов диагностики иерсиний является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации нуклеиновых кислот,,.198520 230 (4732) 1350-4). ПЦР, как метод экспресс - диагностики, позволяет с высоким уровнем специфичности и чувствительности не только идентифицировать вид микроба за 3-4 часов,но и одновременно получить дополнительную информацию об эпидемической значимости возбудителя по ряду признаков, в том числе по отношению к антибиотикам. Такими 2 возможностями обладают различные модификации метода, в том числе вариант в формате мультиплекс. Мультиплексная ПЦР позволяет одновременно использовать комплекс праймеров, комплементарных нескольким маркерным участкам генома объекта-мишени. Это значительно увеличивает точность и специфичность детекции. Преимущество этого метода заключается в оптимальности для массовых скрининговых исследований полевого материала, как при плановом эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы, так и при выявлении случаев заболевания людей чумой. Известен набор рода- и видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, содержащий два родоспецифичных праймера и три видоспецифичных праймера, которые используют для амплификации участков генапорина иерсиний при осуществлении способа детекции и видовой идентификации бактерий родас помощью мультиплексной ПЦР ( 2354700, 12 15/11, 12 1/68, 10.05.2009). Применение изобретения позволяет одновременно детектировать и дифференцировать патогенные и непатогенные виды бактерии рода , а также проводить видовую идентификацию патогенных для человека видов бактерий рода . Известный набор не обладает требуемой аналитической специфичностью системы праймеров применительно к очаговым по чуме территориям Казахстана и из-за значительной стоимости реагентов не может быть использован для планового эпизоотологического обследования не только очаговых (40 территории), но и потенциально очаговых по чуме территорий. Известен способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида, включающий выделение ДНК из культуры клеток и проведение тестирования с использованием набора праймеров в реакции ПЦР,который проводят в два этапа идентификация в пробе ДНК штамма возбудителя чумы и одного из его дополнительных подвидов внутривидовая дифференциация( 2404251,121/00,20.11.2010). Описанные набор праймеров и способ идентификации и внутривидовой дифференциации являются сложными и дорогостоящими в использовании применительно к большим очаговым по чуме территориям Казахстана. Задачей настоящего изобретения является разработка и синтез системы праймеров к маркерным генам . родовой (уорЕ) и видовой(1 и ) принадлежности, а также создание на их основе мультиплексной тест-системы для выявления чумного микроба методом стандартной ПЦР. Предлагаемая система праймеров уорЕ 1, предназначенная для ПЦР в формате мультиплекс, обладает всеми необходимыми свойствами тест-систем подобного рода для качественного проведения мультиплексной ПЦР специфичностью и высоким уровнем чувствительности. Тест-система может быть использована для индикации зараженных объектов как инструмент экспресс-диагностики чумы с высоким уровнем информативности. Перечень фигур чертежей На фиг. 1 показаны результаты амплификации с системой праймеров на гены чумного микроба уорЕ,1,в ПЦР в формате мудьтиплекс 1 - М 1 к 2- (481 ) С - (700 ) Фиг. 2 демонстрирует результаты исследования блох методом ПЦР 1 - положительный контроль 2 отрицательный контроль 3 - суспензия блох.- 104 м.к./мл 7 - взвесь .105 м.к./мл 8 - взвесь . - 106 м.к./мл, А 1, В . Изобретение заключается в создании системы праймеров для использования в ПЦР в режиме мультиплекс для выявления нуклеотидных последовательностей ДНК чумного микроба, кодирующих родовые и видовые признаки. В состав системы входят праймеры,специфичные по отношению к генам чумного микроба уорЕ,и . Разработана специфичная, чувствительная и экономичная тест-система, позволяющая определять принадлежность микроорганизмов к роду , а также идентифицировать и дифференцировать патогенный для человека вид Подробное описание изобретения. Было использовано 79 штаммов различных видов микроорганизмов, в том числе 70 штаммов основного подвида возбудителя чумы, выделенных на территории Казахстана. Кроме того,экспериментальные исследования проводились на суспензии блох, отловленных на очаговых по чуме территориях Жамбылской и Кызылординской областей в 2009-2011 гг. Выделение ДНК микробов осуществлялось с использованием набора реагентовдля обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний методом ПЦР производства ООО Лаборатория Изоген (Россия). Праймеры, использованные для создания ПЦРмультиплекс тест-системы, были разработаны специалистами КПЦКЗИ (Казахский научный центр карантинных зоонозных инфекций, г. Алматы,Казахстан) и Медицинского отделения Техасского Университета (г. Галвестон. США). Праймеры 1 синтезированы специалистами КНЦКЗИ совместно со специалистами ИОГЦ МОП РК остальные компоненты были приготовлены в лаборатории Техасского Университета с участием специалистов КНЦКЗИ. Синтез праймеров проводился традиционным фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК -800 (, Россия). Очистка полученного продукта (праймеров) от примесей (недосинтезированных и делетированных продуктов, удаленных защитных соединений,неорганических солей и т.д.) проводилась накартриджах - (,США). Целевой продукт задерживался на сорбенте картриджа, а нежелательные примеси вымывались. В конце процедуры целевой продукт смывается с сорбента соответствующим раствором. Далее очищенный продукт высушивался в ротационный концентраторе со встроенным мембранным насосом и хранился в специальных флаконах с соответствующей маркировкой при температуре 20 С. Подбор праймеров был произведен на основе схожести оптимальной температуры отжига, что позволило разработать общую программу амплификации специфичных иуклеотидных последовательностей. Гены чумного микроба, на выявление которых направлены используемые праймеры, локализованы на трех основных плазмидах. Ниже приведены основные характеристики генов.- родоспецифичный для иерсиний ген вирулона . Вирулон- единая система,позволяющая внеклеточно расположенным иерсипиям противостоять неспецифическому иммунному ответу в результате нарушения фагоцитарной и сигнальной активности макрофагов. Белок, кодируемый , ингибирует фагоцитоз,препятствует перевариванию микроба внутри фаголизосом. Ген уорЕ локализован на плазмиде размером около 70, также известной какили . Он кодирует эффекторный белок цитотоксического действия. Плазмидаимеется у всех трех патогенных видов иерсиний. в значительной степени обуславливая их вирулентный профиль. Исходя из этого, ген уорЕ и некоторые другие гены,расположенные на плазмиде , могут служить маркерами принадлежности к группе патогенных иерсиний. Видоспецифичный ген 1 локализован на плазмиде капсулоиродукции(или рМТ 1) размером 110 . Он кодирует антиген фракции 1,являющийся основным компонентом капсулы., играет роль в адгезивной активности бактерии, защищает клетки . от захвата интактными фагоцитами хозяина, отвечает за внутриклеточное переживание возбудителя. Ген располагается на плазмиде пестициногенности(или ) размером 9,5 и кодирует белок-активатор плазминогена,определяющего фибринолитическую и плазмокоагулазную активности чумного микроба. Обе плазмиды ( и ) имеются только у чумного микроба и, следовательно, расположенные на них гены, такие каки , могут быть использованы в качестве маркеров видовой принадлежности. Патогенные иерсинии могут время от времени утрачивать некоторые из плазмид. В связи с этим использование для анализа маркерных генов,представленных на всех трех основных плазмидах. позволит повысить точность и специфичность видовой идентификации чумного микроба. С целью достижения максимальной чувствительности и специфичности проводилась оптимизация условий ПЦР, включая подбор оптимальной температуры отжига. В качестве материала для оптимизации были взяты типичные штаммы . штамм 402, выделенный из посева внутренних органов большой песчанки, а также штаммы 1183, 3710, 3061, выделенные из посевов блох, выловленных на территории Прибалхашского автономного природного очага чумы (Казахстан). Эти штаммы, являются характерными по всем основным биохимическим признакам,фаголизабельности,антигенным свойствам для изолятов из Среднеазиатского пустынного природного очага чумы. При предварительном тестировании штаммов методом стандартной ПЦР с использованием тест-систем для детекции чумного микроба производства фирмизготовителей России (ИзоГен, ГенПест) и(Казахстан) и Техасского Университета (США),были выявлены основные гены вирулентности гены вирулона(уорЕ, уорН), гены 1, , , . В некоторых из приведенных штаммов .отсутствовал один или два гена так у штамма 1183 не был выявлен ген , у штамма 3710 - геныи , а у штамма 3061 - ген . В качестве отрицательного контроля использовались деионизированная вода, а также ДНК родственного, но не содержащего данные гены(кроме генов вирулона , свойственных всем патогенным иерсиниям) вид-. Температура отжига для систем праймеров определялась эмпирически. Реакции амплификации с использованием системы праймеров (уорЕ 1 Программа амплификации на выявление генов уорЕ, 1,чумного микроба Этап 1 2 Реакция амплификации проводилась с использованием термоциклеров Рх 2 (,Великобритания). Реакционную смесь готовили двумя способами. В первом случае смесь готовилась на основе ПЦР-набора(2)(, Канада). Во втором случае смесь готовилась из отдельных компонентов 0,5 мкл 10 мМ , 2,5 мкл 10 х ПЦР буфера (10 мМ КС 1, Число циклов 1 35 100 мМ Трис НС 1, рН 9,0) и 0,5 единиц ДНКполимеразы (, ). В обоих вариантах к смеси добавляли 10 пмоль каждого праймера(табл.2), 25 нг ДНК матрицы (полученной из разных штаммов бактерий вида.) и деионизированную воду до конечного объема 25 мкл. Таблица 2 Состав праймеров и размер ампликонов генов уорЕ, 1 и. Учет результатов проводили по окончании амплификации в 1,5 агарозном геле с добавлением раствора бромистого этидия в соответствии с руководством Т. Маниатиса (Маниатис Т., Фрич Э.,Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984). Гель готовился из расчета 1,5 г агарозы на 100 мл 10 х ТВЕ-буфсра, после чего его нагревали и кипятили в течение 1,5 мин. до полного растворения агарозы. После охлаждения геля до температуры около 60 С в него добавляли 2 мкл раствора бромистого этидия и после тщательного перемешивания 4 заливали в гелевую ванночку с предварительно установленными в нее гребенками, избегая появления пузырьков воздуха. Через 30 мин. помещали ванночку с гелем в электрофоретическую камеру, заполняли камеру 10 х ТВЕ-буфером, удаляли гребенки и заливали в образовавшиеся лунки 10 мкл раствора ампликонов,смешанного с 5 мкл раствора красителя (бромфенолового синего). Параметры электрического тока для создания электрического поля были следующими 80 В, 100 мА в течение 30 мин. Визуализация молекул ДНК проводилась с использованием трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете. Молекулы бромистого этидия интеркалировавшиеся в ампликоны флуоресцировали ярко оранжевым цветом, тем самым позволяя детектировать их местоположение в геле и, соответственно, их размер(при использовании маркера). Ожидаемые размеры ампликонов (табл. 2) - 700 п.н. для , 481 п.н. для уорЕ и 304 п.н. для 1. Результаты амплификации приведены на фиг. 1. Аналитическая чувствительность праймеров была проверена методом десятикратных разведений суспензий чумного микроба. Для тестирования взят штамм . . Амплифицированы суспензии в концентрациях от 101 м.к. в мл до 106 м.к. в мл. Праймеры 1 выявляют микробы в концентрации 102103, уорЕ и- 103 м.к. в мл. По результатам полевых и экспериментальных исследований стало известно, что бактериологическое исследование суспензии блох имеет низкий уровень чувствительности. Даже индивидуальное исследование блох позволяет регистрировать 10-40 колоний микроба при концентрации его в заражающей крови, равной 105 м.к. При меньшей концентрации микроба посевы каждой блохи дают отрицательный результат. Повышение чувствительности лабораторных исследований полевого материала с помощью использования ПЦР,особенно в формате мультиплекс, максимально расширяет информационный диапазон, позволяет в относительно короткие сроки провести многофакторный анализ популяции чумного микроба изучаемой территории. Специфичность системы праймеров доказана тестированием близкородственных микроорганизмов,возбудителей некоторых зоонозов и ряда кишечных инфекций, а также суспензий блох, предварительное тестирование которых праймерами 1 идало отрицательные результаты (таблица 3). Таблица 3 Изучение специфичности системы праймеров уорЕ 1 п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Как видно из таблицы 3 амплификация прошла положительно лишь с родоспецифическими праймерами уорЕ при тестировании микроорганизмов рода(., .). В остальных случаях результаты ПЦР были отрицательными. Тест-система уорЕ 1 была апробирована на полевом материале. Были исследованы групповые суспензии блох,специфичных для больших песчанок, собранных на природноочаговой по чуме территории в Жамбылской (2009) и Кызылординской (2010, 2011) областях. Примечателен тот факт, что эти суспензии дали отрицательные результаты при бактериологическом исследовании. Применение метода ПЦР в двух суспензиях блох . и (Жамбылская ПЧС) выявило наличие ДНК чумного микроба. Блохи были собраны на территории одного из секторов ландшафтнозпизоотологического района (ЛЭР) Кромка песков Таукумского автономного очага чумы. В секторе,где был добыт материал, эпизоотия общепринятыми лабораторными методами не выявлена. Лишь применение метода ПЦР позволило установить факт циркуляции чумного микроба в местной популяции больших песчанок. Уровень свечения продуктов амплификации в геле (фиг. 2) соответствовал концентрации суспензии бактерий .103 м.к./мл. Такие результаты вместе с данными других методов лабораторного исследования, скорее свидетельствуют о спаде активности эпизоотии на этом участке. Таким образом, предлагаемая система праймеров уорЕ 1 обладает необходимой специфичностью и высоким уровнем чувствительности для качественного проведения мультиплексной ПЦР. Тест-система может быть использована для индикации зараженных объектов как инструмент экспресс-диагностики чумы с высоким уровнем информативности, при этом снижаются затраты на расходные материалы и реактивы для постановки ПЦР. Кроме того, система праймеров дает возможность производства тестсистемы, которая разрешит проблему использования метода ПЦР в плановом эпизоотологическом обследовании не только очаговых, но и потенциально очаговых по чуме территорий по причине значительного снижения стоимости реагентов. Это немаловажный факт для Казахстана,где почти 40 территории занято природными очагами чумы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Система праймеров 1 используемая в качестве тест-системы выявления ДНК чумного микробаметодом полимеразной цепной реакции в режиме мультиплекс.