Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК геномодифицированного рапса линии MS8, RF3, и RT73 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

(51) 12 19/30 (2011.01) 12 1/68 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат может быть достигнут путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенных линий рапса включающего в себя праймеры и пробы. Создают наборы синтетических олигонуклеотидов, выявления ДНК генетически модифицированной (ГМ) линии рапса 8 праймеры 5-3, 53 и пробу 5- АТТС-3-,где 1 означает присоединенный к 3-концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,флуоресцентный краситель , присоединенный к нуклеотиду Т. Для выявления ДНК ГМ линии 3 трансгенного рапса праймеры 5-3 и 5-3 и пробу 5-()-3-. Для выявления ДНК ГМ линии 73 трансгенного рапса праймеры 53, 5-3 и пробу 5-Т ТССАТССТССТТ-31. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение линий трансгенного рапса с высокой точностью в биологическом материале (семена растения, органы растения). Достижения технического результата заключается в том, что наборы синтетических олигонуклеотидов позволяет выявить ДНК трех линий генетически модифицированного (ГМ) рапса 8, 3 и 73 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.(72) Турганбаева Асия Каирбековна Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Ергалиева Алия Женисовна Старцев Вениамин Александрович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ГЕНОМОДИФИЦИРОВАННОГО РАПСА ЛИНИИ 8, 3, И 73 МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству,биотехнологии,молекулярно-генетической диагностике генетически модифицированных растений и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трех линий генетически модифицированного рапса 8, 3 и 73 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для экспресс-диагностики генетически модифицированного рапса в ПЦРлабораториях, так и в научно- исследовательских целях. Задача изобретения - разработка набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трех линий генетически модифицированного рапса 8, 3 и 73. Изобретение относится к сельскому хозяйству,биотехнологии,молекулярно-генетйческой диагностике генетически модифицированных растений и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трех линий генетически модифицированного рапса методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для экспресс-диагностики генетически модифицированного рапса в ПЦР-лабораториях, так и в научноисследовательских целях. Генетически модифицированные источники появились в начале 90 х годоввека и представляют собой сырье для производства пищевых продуктов, полученное с применением генетически модифицированных организмов. ГМО организмы, полученные с помощью технологии генной инженерии (технологии рекомбинантных ДНК), метода позволяющего направленно изменять генетические характеристики организма,в результате манипуляций с носителями генетической информации (генами). Генная инженерия - основной метод современной биотехнологии, основные идеи метода были предложены в начале 70 х годов,бурное развитие биотехнологии в последующее время привело к созданию ряда генетически модифицированных организмов. Преимущества метода по сравнению с методом классической генетической селекции заключается в значительной скорости получения результата,а также использование новых генетических свойств за счет переноса чужеродных генов в генетически модифицируемый организм. При этом ГМО приобретает новые, уникальные свойства, которые делают значительно более выгодным его применение по сравнению с изогенными,исходными, генетически не измененными формами. В настоящее время технологии получения ГМО наиболее распространены для получения генетически модифицированных растений. При этом, из года в год наблюдается стабильное увеличение посевных площадей, используемых для производства генетически модифицированных растений. За последние тринадцать лет наблюдается более чем 80-ти кратное увеличение посевных площадей, отводимых под выращивание ГМР. В 2009 году 134 млн. гектар было засеяно трансгенными растениями, по неофициальной статистике, включающей неучтенные трансгенные посевы -180 млн. гектар. При общей динамике роста численности население Земли к 2050 году составит около 9,2 млрд. человек (сейчас это 6,1 млрд.), таким образом,потребуется двукратное увеличение производства пищи. С учетом этого остро встает вопрос об увеличении эффективности производства пищи с каждого гектара земли, поэтому трансгенные растения находят свое применение, технологии их создания совершенствуются и постоянно масштабируются. Так, несмотря на кризис, в 2009 году были достигнуты рекордные результаты в области производства четырех основных трангенных культур трансгенная соя - 77 из 90 2 млн. гектар были трансгенными, хлопок - 49 (из 33 млн. гектар), кукуруза - 29 (из 158 млн. гектар),рапс - 21 (из 31 млн. гектар). Исходя из этого, необходимо наладить методы экспресс диагностики генетически модифицированных растений в лабораторных условиях. Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) - высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления трансгенной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании(амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данной трансгенной линии. Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики трех линий рапса с применением метода ПЦР в режиме реального времени. Аналог изобретения. Известна работа Гудова В.П. Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени в которой предложен подход по созданию отечественной методической и компонентной базы для производства зондов для ПЦР в реальном масштабе времени, необходимых для решения различных биотехнологических задач с применением данного метода. В патенте РФ 2004 г.2259401 Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения ПЦР анализа. В изобретении представлен способ получения сухой смеси реагентов путем лиофильного высушивания водного раствора,содержащего ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, буферные компоненты, краситель для электрофореза, -глюкозу, инулин и маннитол, пригодную для проведения ПЦР анализа генетически модифицированных источников. Аналог имеет следующий недостаток детекция результатов ПЦР производится с помощью электрофореза в агарозном геле, что отражается на низкой производительности данного анализа, более того,этот метод обладает низкой чувствительностью,характерной для электрофоретического разделения продуктов ПЦР в агарозном геле. Преимущества изобретения заключается в использовании набора синтетических олигонуклеотидов и пробы для диагностики геномодифицированного рапса линий 8, 3 и 73 с применением метода ПЦР в режиме реального времени подобранных в результате программного анализа области вставки таким образом, что обеспечивают высокую специфичность выявления целевой последовательности трансгенных вставок линий рапса, смещение флуорофора в пробе в его центр позволяет снизить уровень фоновой флуоресценции,а при прохождении ПЦР увеличить чувствительностью метода выявления трансгенной вставки. Задача изобретения - разработка набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трех линий генетически модифицированного рапса 8, 3 и 73. Технический результат может быть достигнут путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенных линий рапса включающего в себя праймеры и пробы. Создают наборы синтетических олигонуклеотидов, выявления ДНК генетически модифицированной линии рапса 8, включающие праймеры 5-3, 53 и пробу 5- ТТС-3-,где 1 означает присоединенный к 3-концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,флуоресцентный краситель , присоединенный к нуклеотиду Т. Для выявления ДНК ГМ линии 3 трансгенного рапса праймеры 5-3 и 5-С)-3-. Для выявления ДНК ГМ линии 73 трансгенного рапса праймеры 5 -3, 5-3 и пробу 5-ТТСС-3-. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение линий трансгенного рапса, с высокой точностью в биологическом материале (семена растения, органы растения). Достижения технического результата заключается в том, что работа над созданием праймеров и пробы (зонда), которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом. Пример 1. Подготовка к работе С помощью открытых, коммерческих баз данных научно-исследовательских статей выбираются наиболее релевантные для выявления трансгенной линии праймеров и зондов, либо на основе анализа баз данных нуклеотидных последовательностей геномов растений,геномодифицированных трансгенных вставок,либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого объекта выбирается участок генома,уникальный для данной трансгенной линии. Используются либо готовые праймеры и зонды,либо с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и один зонд). Для этого секвенированная последовательность выравнивается с гомологичными последовательностями(близкородственных геномов растений) и подбираются праймеры уникальные для искомой последовательности. Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре. Зонд метится красителем(карбоксифлуоресцеин) через тимин в центральной части зонда. Точная позиция рассчитывается с помощью специальной программы. С 3-конца зонд метится гасителем флуоресценции 1. Зонд служит для визуализации ПЦР продукта и отражения динамики его накопления. С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для выявления одной из трех линий трансгенного рапса. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение любой из трех линий трансгенного рапса с высокой точностью в биологическом материале (семена растения, органы растения). Пример 2. ПЦР набор синтетических олигонуклеотидов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенных линий рапса включающего в себя праймеры и пробы Трансгенная линия рапса 8 Праймеры 5-3 5-3 Проба 5 ААТ-3 -1 Трансгенная линия рапса 3 Праймеры 5-3 5-С-3 Проба 5-3- 1 Трансгенная линия рапса 73 Праймеры 5-3 5 -А-3 Проба 5-3- 1,где 1 означает присоединенный к 3 концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,флуоресцентный краситель ,присоединенный к нуклеотиду Т. Пример 3. Составная часть набора следующих веществ. Указанные наборы синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ. 1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные трансгенной области одной их трех линий рапса, смесь дезоксирибонуклеотид- трифосфатов четырех типов,реакционный буфер (100 мМ - ( 8.8 при 25 С), 500 мМ КС 1, 0.8 Р 40, 20 мМ 2),внутренний контрольный образец (ВК). Праймеры представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к трансгенной области каждой из трех линий рапса,вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта, проба (зонд) каждой из трех линий рапса служит для визуализации ПЦР-продукта в режиме реального времени. Краситель и тушитель в зонде находятся в тесном взаимодействии, гаситель препятствует флуоресценции красителя. За счет 5-3 экзонуклеазной активности -полимеразы при синтезе ПЦР-продукта происходит высвобождения красителяи его флуоресценция, что фиксируется детектирующим прибором. Внутренний контрольный образец(ВК) представляет собой ДНК- последовательность,вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб. 2) Раствор фермента -полимеразы. 3) Положительный контрольный образецДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом трансгенной вставки. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при положительной реакции. Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными. 4) Отрицательный контрольный образецобразец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент. Пример 4. Подготовка к проведению реакции ПЦР в реальном времени Данный набор применяется следующим образом. 1) Биологический материал (семена растения,органы растения) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента) в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК,которую в свою очередь используют для ПЦР. 2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов. 3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор полимеразы. 4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К- (отрицательный контрольный образец),К(положительный контрольный образец вносится выделенная согласно п.1) ДНК. 5) В пробирку, маркированную К- вносится отрицательный контрольный образец. 6) В пробирку, маркированную К вносится положительный контрольный образец. 7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно следующей программе 1 цикл 94 С - 600 секунд, 50 циклов 94 С - 15 секунд, 60 С - 60 секунд, 1 цикл 72 С - 10 минут. Используется амплификаторы в режиме реального времени. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору. В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается,что ведет к возрастанию уровня флуоресценции,4 который фиксируется специальными приборами детектирующими амплификаторами. Таким образом в лабораториях и в научноисследовательских целях рекомендуем использовать наборы синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трех линий генетически модифицированного рапса 8, 3 и 73. Пример 5. Детекция результатов амплификации в реальном времени Следующий этап метода - детекция результатов амплификации ДНК. Обнаружение продуктов ПЦР происходит в результате анализа флуоресценции зондов, в итоге использования анализа ПЦР в реальном времени амплификация и детектирование происходят одновременно. В основе лежит технология .основан на использовании 5-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5-конце флуоресцентным красителем, а на З-конце фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Пробы комплементарны участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка,гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение детектируется. Таким образом, увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного продукта. Например, при тестировании в семенном материале с использованием тест-системы, которая позволяет выявить одновременно ДНК растений и наиболее распространенные ГМ последовательности промотора 35 вируса мозайки цветной капусты. В качестве анализируемых образцов взяли семена рапса. Показаны результаты проведения ПЦР в режиме реального времени на идентификацию растительной ДНК по каналу . Результаты реакции положительные, выделенная ДНК растительного происхождения пригодна для анализа на наличие ГМО (фиг.1). Параллельно в той же пробирке происходила идентификация регуляторных элементов генетически модифицированных организмов (35 промотор, -терминатор). В результате анализа в нескольких образцах рапса (2, 4, 13) были обнаружены генетически модифицированные последовательности промотора 35 и терминатор(фиг.2). Таким образом, в результате ПЦР анализа были обнаружены наиболее распространенные генетически модифицированные последовательности промотора 35 и терминаторав семенах рапса (2, 4, 13). Присутствие генетических последовательностей свидетельствует о генетической модификации генома рапса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК геномодифицированного рапса линии 8, 3 и 73 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени,включающий реакционную смесь с праймерами и пробой, специфичной трансгенной области линий 8,3 и 73 рапса,смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов,реакционный буфер, раствор фермента полимеразы, отличающийся тем, что используют флуоресцентно-меченные праймеры для линии рапса 8, имеющую следующую последовательность нуклеотидов 5-3-3-1 для выявления ДНК ГМ линии 3 трансгенного рапса используют праймеры 53 53 пробу 5-3-1 для выявления ДНК ГМ линии 73 трансгенного рапса используют праймеры 53 53 пробу 5