Способ диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц методом полимеразной цепной реакции

(51) 12 15/10 (2010.01) 01 33/53 (2010.01) 01 33/569 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ(57) Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики вируса инфекционного ларинготрахеита птиц. Способ осуществляется путем постановки полимеразной цепной реакции, при которой с использованием синтезированных специфических праймеров выявляют ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита. Способ позволяет обнаруживать ДНК вируса ИЛТ с довольно высокой степенью точности в короткие сроки, что позволяет диагностировать данную инфекцию за 6 часов.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Жолдыбаева Елена Витальевна Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Зайцев Валентин Лукьянович Кыдырбаев Жайлаубай Кыдырбаевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 18876 Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа выявления возбудителя инфекционного ларинготрахеита птиц(ИЛТ). Известен способ дифференциальной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц с помощью метода простой полимеразной цепной реакции(ПЦР). При известном способе, как в предложенном,предварительно выделяют ДНК вируса ИЛТ. Далее проводят полимеразную цепную реакцию. В известном и в предложенном способах используют праймеры, которые синтезируют на район гена тимидинкиназы,обладающий высокой консервативностью его аминокислотных остатков. Однако используемые в известном способе специфические праймеры имеют другие последовательности (прямой), (обратный). Продукт,образующийся в результате амплификации, составляет 300 п.о. (пар оснований). Амплификацию проводят при температурновременном режиме отжиг при 50 С, элонгация при 72 С - 2 мин в течение 40 циклов. Анализ ПЦРпродуктов в известном способе и предложенном проводят в 2 агарозном геле. Недостатком данного способа является то, что для работы специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта необходим длительный температурно-временной режим,который значительно увеличивает время проведения исследований и тем самым постановку диагноза.( ,. ,.// . . . 1994.-.-50.-. 313-322). Задачей является разработка высокочувствительного и эффективного метода диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц на основе полимеразной цепной реакции. Технический результат Способ диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц высокочувствительным и специфичным методом полимеразной цепной реакцией позволяет точно и очень быстро (до 6 часов) выявлять ДНК вируса ИЛТ у птиц с разными клиническими симптомами болезни, при смешанных инфекциях, при состоянии латенции. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Описание сущности изобретения Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение вирусной ДНК, синтез праймеров,постановку ПЦР,проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Выделение ДНК из органно-тканевых материалов птиц 20 20 20 15 2 секунд секунд секунд минут Из образцов исследуемого биологического материала готовят 20 суспензию (вес/объм). Вирусные белки удаляют обработкой протеолитическим ферментом - протеиназой К. В очищенную суспензию вируса добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл,додецилсульфата натрия до конечной концентрации 0,5. Полученную смесь инкубируют при 56 С в течение 1 ч, при этом происходит лизис и выделение ДНК. ДНК очищают двукратным экстрагированием равными объемами фенола и фенолахлороформа. Каждую экстракцию проводят медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы разделяют центрифугированием при 15600 при комнатной температуре в течение 5 мин. Конечную водную фазу отбирают и экстрагируют равным объемом смеси хлороформизоамиловый спирт (964). Водную фазу отбирают и к ней добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного 96 этанола. Осаждение ДНК проводят центрифугированием при 15600 в течение 15 мин при температуре 4 С. Осадок ДНК дважды промывают 70 этанолом,высушивают на воздухе и растворяют в необходимом объеме ТЕ буфера (10 мМ трис-, 1 мМ ЭДТА,8,0). Олигонуклеотидные праймеры Используя компьютерные пакетные программы конструируют специфические праймеры. Длина праймеров составляет 22 нуклеотида. Данные праймеры ограничивают участок ДНК размером 303 п.о. Праймеры к ДНК-последовательности вируса ИЛТ, синтезируют на синтезаторе олигонуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды элюиуют с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривают в вакуумном испарителе. Преципитат праймеров растворяют в ТЕ буфере и переосаждают этанолом, ресуспендируют в деионизированной воде и хранят при -20 С. Полученные таким образом синтезированные праймера разбавляют до концентрации 20 пкмоль и в дальнейшем их используют для постановки ПЦР. Проведение ПЦР ПЦР проводят в реакционней смеси конечного объема 50 мкл следующего состава Н 2 О - 39,0 мкл 5 мкл 10 буфера (100 М Трис НС 1, рН 8,3, 152, 750 М КС) 1 мкл дНТФ (10 мМ раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) по 1 мкл каждого праймера с концентрацией 10 пмоль, 2 мкл фермента-полимеразы с концентрацией 1 ед/мкл, 1 мкл ДНК вируса. Режим времени и температуры, используемый при амплификации 5 минут 95 С 18876 Наработку специфических участков ДНК проводят в термоциклере. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК Электрофорез продуктов амплификации ДНК вируса ИЛТ птиц проводят в аппарате для горизонтального электрофореза при напряжении 8 В/см. Для электрофореза используют 2 (в/о) раствор агарозы в трис-боратном буфере (ТВЕбуфере). Визуализацию ДНК проводят в УФ-свете. Документирование полученных результатов проводят при помощи фотографирования гелей в УФ-свете. Фиг. 1 демонстрирует конечный результат предлагаемого способа диагностики. Пример В работе используют следующие вируссодержащие материалы вакцинный штамм Отар вируса ИЛТ. Получен сотрудниками НИСХИ в 1994 году путем клонирования вируса ИЛТ из патологического материала- вакцинный клон НТ штамма ЦНИИПП вируса ИЛТ, полученный из ВНИИВВиМ (г. Покров Владимирской области)- вирулентный штамм Майкудукский вируса ИЛТ. Выделен на майкудукской птицефабрике от больных птиц в декабре 2001 года- вакцинный штамм Ла-Сота вируса болезни Ньюкасла (АЖ)- вакцинный штамм Росток вируса гриппа птиц (АЖ)- вирус инфекционного бронхита птиц (АЖ)(АЖ) вакцинный штамм ВГНКИ вируса болезни Ауески (культуральный) вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (культуральный) органно-тканевой материал гортань, трахея, легкие, печень от павшей курицы из Илийского района. 26.07.2004 г. специфические праймеры к ДНКпоследовательности вируса ИЛТ-1-Выделение ДНК из органно-тканевых материалов птиц Образцы исследуемого биологического материала(гортань, трахея, легкие, печень) мелко нарезают с помощью скальпеля и помещают в ступки с песком. Материал растирают до образования однородной массы, и добавляют физиологический раствор для получения 20 суспензии (вес/объм). Вирусные белки удаляют обработкой протеолитическим ферментом - протеиназой К. В 20 секунд 20 секунд 20 секунд 15 минут 72 очищенную суспензию вируса добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл,додецилсульфата натрия до конечной концентрации 0,5. Полученную смесь инкубируют при 56 С в течение 1 ч, при этом происходит лизис и выделение ДНК. ДНК очищают двукратным экстрагированием равными объемами фенола и фенолахлороформа. Каждую экстракцию проводят медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы разделяют центрифугированием при 15600 при комнатной температуре в течение 5 мин на центрифуге . Конечную водную фазу отбирают и экстрагируют равным объемом смеси хлороформизоамиловый спирт (964). Водную фазу отбирают и к ней добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного 96 этанола. Осаждение ДНК проводят центрифугированием при 15600 в течение 15 мин при температуре 4 С. Осадок ДНК дважды промывают 70 этанолом,высушивают на воздухе и растворяют в необходимом объеме ТЕ буфера (10 мМ трис-, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Олигонуклеотидные праймеры Используя компьютерные пакетные программыМАХ 1.0, конструируют специфические праймеры -1 и -1. Длина праймеров составляет 22 нуклеотида. Данные праймеры ограничивают участок ДНК размером 303 п.о. Праймеры к ДНК-последовательности вируса ИЛТ, синтезируют на синтезаторе олигонуклеотидов 8900 М. Полученные олигонуклеотиды элюируют с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривают в вакуумном испарителе, . Преципитат праймеров растворяют в ТЕ буфере и переосаждают этанолом,ресуспендируют в дистиллированной воде и хранят при-20 С. Полученные таким образом синтезированные праймера используют для постановки ПЦР. Проведение ПЦР В работе используют следующие праймеры-1-ПЦР проводят в реакционной смеси конечного объема 50 мкл следующего состава Н 2 О - 39,0 мкл, 5 мкл 10 буфера (100 М Трис НС 1, рН 8,3, 152, 750 М КС) 1 мкл дНТФ (10 мМ раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) по 1 мкл каждого праймера с концентрацией 10 пмоль, 2 мкл фермента-полимеразы с концентрацией 1 ед/мкл,1 мкл ДНК вируса. Режим времени и температуры, используемый при амплификации 5 минут 95 С 18876 Наработку специфических участков ДНК проводят в термоциклере 9700, . Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК. Электрофорез продуктов амплификации ДНК вируса ИЛТ птиц проводят в аппарате для горизонтального электрофореза -100, фирмы,при напряжении 8 В/см. Для электрофореза используют 2 (в/о) раствор агарозы в трис-боратном буфере(ТВЕ-буфере). Визуализацию ДНК проводят в УФ-свете с длиной волны 254 нм,на приборе. Документирование полученных результатов проводят при помощи фотографирования гелей в УФ-свете,с использованием оранжевого светофильтра на цифровую фотокамеру . В качестве маркера молекулярных масс используюти 1, фирмы . ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц, включающий выделение ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита птиц,проведение полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле, отличающийся тем,что используют специфические праймеры, имеющие следующие нуклеотидные последовательности Фиг.1 Электрофореграмма продуктов амплификации при использовании праймеров на ИЛТ 1 и 2 а) М -маркер, 10.000 п 50 , 1- контроль (2), 2,3,7,8 - ДНК вируса ИЛТ штамм Отар (303 п.о.), 4 - ДНК вируса ИЛТ клон НТ штамм ЦНИИПП (303 п.о.), 5,6 - ДНК вируса ИЛТ штамм Майкудукский(303 п.о.), 9 - ДНК вируса ИЛТ из органо-тканевого материала (303 п.о.) б) определение специфичности ПЦР при выявлении ДНК вируса ИЛТ, М- маркер, 10.000 п - 50 п, 1 - отрицательный контроль (Н 2 О), 2 положительный контроль (ДНК вируса ИЛТ, штамм Отар, (303 п.о.), 3- вирус болезни Ньюкасла, аллантоисная вируссодержащая жидкость(АЖ), 4 - вирус гриппа птиц, аллантоисная вируссодержащая жидкость, 5-вирус инфекционного бронхита птиц, аллантоисная вируссодержащая жидкость, 6 - ДНК вируса оспы кур ПЦР с ДНК гетерологичных герпесвирусов 7- ДНК вируса болезни Ауески, 8 - ДНК вируса инфекционного ринотрахеита КРС.