Способ выделения днк вируса инфекционного ларинготрахеита птиц для пцр-анализа

(51) 12 15/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ ДЛЯ ПЦР-АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно - к способам выделения ДНК. Сущность его заключается в выделении ДНК вируса ИЛТ птиц из вирус-содержащих материалов путем лизиса и инактивации протеаз с применением лизирующего буфера,состоящего из гуанидинизотиоционата с последующей сорбцией ДНК на частицах диоксида кремния. Предлагаемый способ является более эффективным по сравнению с известными процедурами выделения вирусного ДНК для ПЦР и предназначен для использования в лабораторных и научноисследовательских учреждениях, занимающихся ПЦР-диагностикой ДНК-содержащих вирусных инфекций. Данный способ выделения ДНК удобен,экономичен, технологичен и пригоден для подготовки образцов к амплификации.(72) Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Жолдыбаева Елена Витальевна Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Строчков Виталий Михайлович Зайцев Валентин Лукьянович Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 21864 Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способам выделения ДНК. Известен широко используемый в молекулярной биологии и генной инженерии фенольный метод выделения ДНК с применением протеиназы К и 10 ДСН для расщепления вируса, удаления белков и выделения ДНК. Недостатком данного метода является его трудоемкость,невысокая эффективность при необходимости работы с такими агрессивными агентами, как хлороформ и фенол. . 66 (1997) 179-186). Предлагаемый способ является более эффективной процедурой выделения ДНК вируса ИЛТ птиц из вируссодержащих материалов для ПЦР анализа и предназначен для использования в лабораторных и научно-исследовательских учреждениях, занимающихся ПЦР-диагностикой ДНК-содержащих вирусных инфекций. Сущность метода выделения ДНК вируса ИЛТ птиц из вируссодержащих материалов заключается в лизисе и инактивации протеаз гуанидинизотиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на частицах диоксида кремния. Приготовление сорбента 6 г двуокиси кремния (2) суспендировать в деионизированной воде (общий объем 50 см 3) в стеклянном цилиндре. Уравновешивать в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем верхнюю водную фазу удалить отсасыванием. Объем верхней фазы может варьировать в зависимости от исходного 2. Оставшийся осадок суспендировать на шейкере, после добавить 50 см 3 воды,перемешать и снова оставить на ночь при комнатной температуре. Затем удалить отсасыванием верхнюю фазу, прилить (в объеме верхней фазы) вновь деионизированной воды и оставить на 5 ч. Удалить отсасыванием верхнюю фазу, которая с каждым разом становится прозрачнее. Осадок перемешать и довести рН концентрированной НС 1 до 2. Разлить готовый 2 по стеклянным сосудам в небольшом объеме и автоклавировать при 121 С в течение 20 мин. Данный раствор хранится при комнатной температуре в темноте в течение 6 месяцев. Приготовление буферов Лизирующий буфер растворить 12 г гуанидинизотиоцианата в 10 см 3 0,1 М Трис-1, рН 6,4 2,2 см 3 0,2 М ЭДТА, рН 8,0, добавить 0,26 г Тритона 100. Примечание для приготовления 0,1 М Трис-,рН 6.4 брать основной Трис (молек. масса 121.14 г/моль),доводить рН соляной кислотой. Промывочный буфер растворить 12 г гуанидинизотиоцианата в 10 см 3 0,1 М Трис-, рН 6,4. Примечание растворять гуанидинизотиоцианат нагреванием в водяной бане при 60-65 С. Внимание гуанидинизотиоцианат при нагревании может выделять токсичный газ Выделение ДНК проводят из органо-тканевых материалов, аллантоисной жидкости и трахеальных смывов. 1 В пробирку объемом на 1,5 см 3 добавляют 900 мкл лизирующего буфера и 50 мкл готового сорбента 2, перемешивают 10 с, затем добавляют 200 мкл исследуемого образца, вновь перемешивают (10 с) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. 2 Смесь осаждают центрифугированием в течение 1 мин (микроцентрифуга ,) при максимальной скорости. Супернатант удаляют,добавляют 1 см 3 промывочного буфера и осадок ресуспендируют на вортоксе, затем осаждают центрифугированием в течение 1 мин при максимальной скорости. 3 Супернатант удаляют и вновь повторяют процедуру с промывочнымбуфером (шаг 2). 4 Супернатант удаляют и добавляют 1 см 3 70 спирта,(осадок не ресуспендировать),центрифугируют 1 мин при максимальной скорости. Вновь промывают 70 спиртом. 5 Удаляют супернатант, осадок высушивают в пробирках с открытыми крышками при 56 С в течение 10 мин. 6 Осадок ресуспендируют в 50 мкл ТЕ-буфера 10 мМ трис-НС 1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0),инкубируют при 56 С в течение 10 мин, затем центрифугируют при максимальной скорости в течение 2 мин. 7 Супернатант переносят в другую пробирку и еще раз центрифугируют при максимальной скорости в течение 1 мин (для удаления оставшихся силика-частиц), затем снова переносят в другую пробирку для последующего использования в ПЦР). В качестве объекта исследований использовали вирус ИЛТ птиц, штамм Отар патологический материал (трахея, гортань) с подозрением на болезнь трахеальные смывы от птиц. Результаты экспериментов подтверждают, что вышеописанная методика позволяет в течение 1 ч выделять вирусную ДНК, пригодную для ПЦР-анализа благодаря быстрому лизису клеток и сорбции ДНК на сорбенте. Метод эффективен тем, что по сравнению с фенольным методом потери ДНК не наблюдаются он удобен, экономичен, технологичен и пригоден для подготовки образцов к амплификации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита птиц для ПЦР-анализа из вируссодержащих материалов отличающийся тем,что в состав лизирующего буфера введен гуанидинизотиоцианат,а после лизиса и инактивации протеаз ДНК сорбируется на частицах диоксида кремния.